论文部分内容阅读
目的探讨genistein对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）活化的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响。方法1.研究genistein长时间干预的作用:（1）体外培养人脐静脉内皮细胞，在ox-LDL（100mg/L）干预内皮细胞的基础上，不同浓度的genistein（10nmol/L，50nmol/L，100nmol/L）孵育24h，MTT法检测HUVECs细胞活力的变化，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和Western blot观察genistein对eNOS表达的影响。（2）经雌激素受体拮抗剂ICI182780（1μ M）或经基因转录阻断剂-放线菌素D（5mg/L）作用30min，再加入genistein（100nmol/L）作用24h，RT-PCR和Western blot检测eNOS的表达。2.研究genistein短时间干预的作用：体外培养人脐静脉内皮细胞，在ox-LDL（100mg/L）干预内皮细胞的基础上，genistein (100nmol/L)分别作用5、10、15、30和60min，Greiss反应测定细胞培养上清中一氧化氮（NO）的含量，RT-PCR检测HUVECs eNOS mRNA的表达，Western blot检测HUVECs eNOS蛋白和磷酸化eNOS（Ser1177）的表达水平；同时，Western blot观察PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002和NSC154020干预后，genistein对HUVECs磷酸化eNOS（Ser1177）表达的影响。结果1.genistein长时间干预的作用：(1)MTT结果显示：ox-LDL（100mg/L）组细胞活力明显受到抑制（P<0.05），而genistein则明显增强内皮细胞增殖活力，随着genistein浓度的升高（10nmol/L，50nmol/L，100nmol/L），细胞活力升高越显著（P<0.05）。(2)RT-PCR和Western blot结果显示：与正常对照组相比，ox-LDL（100mg/L）组明显下调eNOS mRNA和蛋白表达（P<0.05），而genistein明显上调eNOS mRNA和蛋白表达（P<0.05）；genistein对eNOS的诱导作用被雌激素受体拮抗剂ICI182780（1μ M）和基因转录阻断剂-放线菌素D（5mg/L）明显的抑制（P<0.05）。2. genistein短时间干预的作用：HUVECs经100nmol/L genistein短时间(5、10、15、30和60min)处理后，培养液NO浓度和磷酸化eNOS(ser1177）表达水平均明显高于ox-LDL组（P均<0.05)，其中genistein15min处理组作用最明显，然而，eNOS mRNA和非磷酸化eNOS蛋白表达水平与ox-LDL组比较无统计学意义(P>0.05)；同时，HUVECs经PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002和NSC154020干预后，磷酸化eNOS（Ser1177）表达明显低于genistein处理组（P<0.05）。结论（1）genistein作用时间比较长（24h）时，通过促进eNOS表达，进而提高eNOS的活性，这个过程和雌激素受体介导的基因组途径密切相关。（2）genistein作用时间比较短（60min以内）时，genistein对eNOS的诱导作用与其促进eNOS（Ser1177）磷酸化进而提高eNOS活性密切相关，PI3K/AKT信号通路在此过程中发挥重要作用。