尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase,UDG)是一种重要的碱基切除修复(BER)的起始酶,可以修复脱氧尿嘧啶(dU)引发的DNA损伤从而维持基因组的完整性。异常的UDG活性与多种人类疾病的发生和发展密切相关,例如人类免疫缺陷,神经退行性疾病,淋巴瘤和癌症等,UDG也因而成为医学诊断以及治疗一些复杂疾病的重要靶标。开发用于检测UDG活性的灵敏方法对于基础生物医学研究和药物发现都是非常必要的,但UDG检测的常规方法通常耗时耗力且灵敏度较差。本论文中,我们基于一些简单、高效的核酸扩增技术及荧光检测手段,提出了两种针对UDG酶活性的新型荧光检测方法。主要内容如下:一、基于荧光共振能量转移机制的UDG活性分析基于阳离子共轭聚合物 PFP(poly[(9,9-bis(6’-N,N,N-triethy-lammonium)hexyl))fluorenylene phenylene dibromide])的荧光共振能量转移(FRET)特性,并结合UDG诱导的限制性核酸内切酶IV(Endo IV)的切割反应,在论文的第二章中我们设计了一种均相的、简单灵敏的、非核酸扩增方法定量检测UDG的活性。当把一条茎部含有4个脱氧尿嘧啶(dU)环部为5个胸腺嘧啶(T)的发夹结构的底物DNA和Endo IV一起温育时,由于dU不会受到影响,发夹结构将保持不变。这时加入嵌入型双链特异性荧光染料SYBR Green I(SGI)以及荧光共轭聚合物PFP作为荧光共振能量转移对,将会发生从PFP到SG I的FRET现象。而当体系中有UDG存在时,由于dU被UDG移除,进而Endo IV切割脱碱基位点(AP位点,AP site)生成单链DNA,SGI不能与之结合,导致FRET不能有效进行。因此,根据FRET效率和UDG的活性之间的反比关系,进而实现对UDG的定量检测。二、基于末端脱氧核苷酸转移酶辅助形成荧光铜纳米簇的UDG活性的高灵敏度分析在第三章中,我们提出了一个基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的核酸扩增方法,以荧光铜纳米簇(CuNCs)作为传感元件实现对UDG的高灵敏度测定。在该研究中,合理设计含有脱氧尿嘧啶的发夹结构DNA作为UDG的底物,其3’末端被2’,3’-双脱氧胞嘧啶(ddC)封闭。UDG可以特异性地移除DNA底物中的尿嘧啶碱基产生脱碱基位点,然后可以通过Enod IV切割该位点以暴露3’-OH末端。TdT将沿暴露的3’-OH末端启动无模板DNA延伸反应,以产生相当长的poly(T)尾,这将作为产生荧光CuNCs的完美模板。通过记录CuNCs的荧光信号,可以如实地反映UDG的活性。相反,如果不存在UDG,则DNA底物的3’-ddC末端不能被TdT识别,因此不会发生基于TdT的延伸反应和CuNCs的形成。使用ddC作为3’-末端封闭基团可以大大减少非特异性DNA延伸并改善信噪比。此外,TdT是一种无模板的、非序列依赖型的DNA聚合酶,可以高效地催化加尾过程,最多可形成数千个碱基长度的poly(T)序列,并且每条poly(T)可以形成许多荧光CuNCs,因此,实现了高灵敏度。此外,在TdT介导的延伸期间,通过引入一条含脱碱基位点的poly(A)寡核苷酸,还初步设计了支化扩增机制,可进一步降低UDG活性的检出限。