论文部分内容阅读
乳杆菌是肠道土著菌群的重要成员之一，能在肠道中定植，能改善或调节肠道微生物菌群的平衡、增强机体免疫力及抑制肿瘤的形成等。研究表明，作为G+细胞壁主要组成成分的肽聚糖和磷壁酸，可能是其免疫原性的主要来源。目前，乳杆菌（如植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌）细胞壁肽聚糖和磷壁酸已被成功分离提取出来，并被证明是一种新型的免疫原和非特异性免疫增强剂。而对干酪乳杆菌细胞壁组分免疫功能相关研究还鲜见报道。本文分离提取干酪乳杆菌细胞壁组分肽聚糖和磷壁酸，通过体外细胞实验，研究所提取的两物质对小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞的激活作用、吞噬功能及细胞因子表达的影响。
以MRS基础培养基对干酪乳杆菌LC2W进行增菌培养，收集对数期菌体，洗涤菌体并采用超声破碎细胞壁，SDS加酶处理去蛋白、DNA及RNA；纯化的细胞壁进一步经三氯乙酸处理分离提取磷壁酸和肽聚糖，并在波长190～600nm范围内采用紫外光谱全波长扫描检测其纯度，选用体外培养的RAW264.7作为研究对象，通过测定干酪乳杆菌LC2W磷壁酸和肽聚糖对RAW264.7细胞活性的影响，探讨此细胞壁两组分的免疫调节作用。
首先，巨噬细胞作为先天性免疫的重要成员，对巨噬细胞的激活与刺激作用是诱导宿主免疫应答的第一步，只有激活的巨噬细胞才能发挥其免疫功能。实验选择观察其受刺激后RAW264.7巨噬细胞形态、MTT代谢水平及细胞内乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化，研究提取的细胞壁主要组分肽聚糖和磷壁酸对巨噬细胞激活途径的影响，结果表明，受刺激后的RAW264.7巨噬细胞形态发生明显变化，在10～100μg/mL浓度范围内，磷壁酸和肽聚糖能够有效增强其代谢能力和LDH活性，并呈一定的剂量依赖性，表明干酪乳杆菌LC2W的磷壁酸和肽聚糖对巨噬细胞具有激活与刺激作用。
其次，实验选择吞噬中性红、肠道致病菌大肠杆菌和沙门氏菌为研究对象，并采用CFDA-SE荧光标记的方法研究磷壁酸和肽聚糖对RAW264.7巨噬细胞吞噬致病菌能力的影响。结果显示，与对照组相比，经磷壁酸和肽聚糖24h刺激后，巨噬细胞吞噬中性红、致病性大肠杆菌和肠炎沙门氏菌能力均有明显增强，并呈剂量依赖性；但经刺激后巨噬细胞吞噬大肠杆菌的能力明显高于沙门氏菌，可能是由于两致病菌的入侵方式存在差异。结果证明了采用CFDA-SE标记，荧光分光光度检测法定量检测致病菌的吞噬功能简便、快速和重复性好，巨噬细胞受磷壁酸和肽聚糖激活后，其吞噬能力明显提高。
最后，研究磷壁酸和肽聚糖对RAW264.7巨噬细胞产生的主要免疫因子的影响。结果显示经磷壁酸和肽聚糖24h刺激后，RAW264.7巨噬细胞释放的NO、IL-12量明显比未经刺激的对照组高，100μg/mL和30μg/mL间差异也显著（P<0.05），而研究还发现，在10～100μg/mL浓度范围内，经刺激后的巨噬细胞产生的抗炎性因子IL-10并没有增加。结果表明磷壁酸和肽聚糖能显著提高生物活性因子（IL-12、NO）的释放，促进巨噬细胞杀伤、清除病原体及肿瘤细胞的作用，从而提高其免疫监视功能。同时，适量的浓度刺激并没有造成过度的炎症反应。