论文部分内容阅读
目的:研究干扰素诱导蛋白10（interferon-inducible protein 10,CXCL10）在烟曲霉菌性角膜炎中的表达及作用机制。方法:本实验分别在烟曲霉菌性角膜炎小鼠动物模型和烟曲霉菌感染的细胞模型上研究了CXCL10的表达规律、甘草酸预处理后对烟曲霉菌感染引起的真菌性角膜炎角膜感染程度的影响以及对相关炎症因子表达变化的影响。据此,本实验从以下四个方面加以证实:1、应用烟曲霉菌分生孢子液刺激人永生化角膜上皮细胞（Human corneal epithelial cells,HCECs）,采用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测正常组和烟曲霉菌刺激4h、8h、10h、12h、16h、20h后HCECs中CXCL10m RNA的表达,确定CXCL10m RNA表达峰值的时间,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测正常组和烟曲霉菌刺激12h、18h、24h、30h、36h后HCECs中CXCL10蛋白的分泌,确定CXCL10蛋白分泌达峰值的时间;2.使用不同浓度的CXCL10抑制剂甘草酸（glycyrrhizic acid,GA）（1.5ng/ml、2.5ng/ml、3.5ng/ml、5ng/ml）预处理HCECs 24小时,采用CCK-8试剂盒检测GA对HCECs的毒性;用不同浓度GA预处理HCECs2h,加入烟曲霉菌分生孢子刺激液刺激16h后,RT-PCR检测不同浓度GA预处理后HCECs中CXCL10m RNA的表达,筛选GA作用的最佳浓度。用最佳浓度的GA预处理HCECs 2h,加入烟曲霉菌分生孢子刺激液刺激16h后,RT-PCR检测CXCL10阻断后HCECs中促炎因子（IL-6、IL-23）和抑炎因子（IL-10、TGF-β）m RNA的表达,24h后ELISA定量检测CXCL10阻断后促炎因子（IL-6、IL-23）和抑炎因子（IL-10、TGF-β）的蛋白分泌。3、建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型,收集1d、3d、5d小鼠角膜,采用RT-PCR检测正常组和烟曲霉菌感染组小鼠角膜中CXCL10m RNA的表达;ELISA法检测正常组和烟曲霉菌感染组小鼠角膜中CXCL10的分泌;4、GA预处理小鼠角膜后建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型,在感染1d、3d、5d,用裂隙灯显微镜来观察记录小鼠角膜感染的严重程度并进行临床评分,髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）测定检测中性粒细胞活性;将C57BL/6小鼠随机分为四组:溶剂对照组、烟曲霉菌感染组、GA预处理组、GA预处理+烟曲霉菌感染组,在感染烟曲霉菌后第3天,收集小鼠角膜,采用HE染色（Hematoxylin-Eosin Staining）观察溶剂对照组、烟曲霉菌感染组、GA预处理+烟曲霉菌感染组、GA预处理组小鼠烟曲霉菌性角膜炎角膜组织病理变化;采用RT-PCR检测溶剂对照组、烟曲霉菌感染组、GA预处理组、GA预处理+烟曲霉菌感染组中促炎因子（IL-6、IL-23、IL-12、IFN-γ）和抑炎因子（IL-10、TGF-β）m RNA的表达;采用ELISA检测溶剂对照组、烟曲霉菌感染组、GA预处理组、GA预处理+烟曲霉菌感染组中促炎因子（IL-6、IL-23、IL-12、IFN-γ）和抑炎因子（IL-10、TGF-β）蛋白的分泌。结果:1、在体外培养人永生化角膜上皮细胞中,加入烟曲霉菌分生孢子刺激液刺激后可以诱导上皮细胞中CXCL10m RNA的表达和蛋白分泌的增加,m RNA的表达在16h达高峰,蛋白分泌在24h达高峰。2、cck8实验检测显示≤5ng/ml GA不会对HCECs产生毒性作用,2.5ng/ml GA对HCECs中CXCL10m RNA的表达有明显的抑制作用,因此选用2.5ng/ml GA进行后续的实验研究。RT-PCR结果显示与正常对照组相比,烟曲霉菌孢子感染组中的IL-10、TGF-β、IL-6和IL-23表达均明显增加,与烟曲霉菌孢子感染组相比,GA预处理的烟曲霉菌孢子感染组中抑炎因子（IL-10、TGF-β）表达量增加,促炎因子（IL-6、IL-23）表达量减少,差异均有统计学意义,ELISA检测在蛋白水平上证实了相关炎症因子的变化。3、在C57BL/6小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型实验中,RT-PCR结果显示在烟曲霉菌感染后CXCL10m RNA表达明显升高,1d达高峰,之后开始下降,ELISA结果显示CXCL10的分泌在烟曲霉菌感染后1d开始升高,3d达高峰。4、GA预处理小鼠角膜的烟曲霉菌性角膜炎模型组中,与溶剂对照组相比,1天、3天和5天的临床炎症评分提示GA预处理小鼠角膜的感染程度明显减轻,MPO检测证明GA预处理小鼠角膜的中性粒细胞活性降低。HE结果显示GA预处理小鼠角膜感染后3天炎性细胞浸润明显减少。RT-PCR结果显示:烟曲霉菌感染小鼠角膜3d后,与单纯烟曲霉菌感染组相比,GA+感染组小鼠角膜中抑炎因子IL-10、TGF-βm RNA表达增加,促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-23m RNA表达减少,差异均有统计学意义,ELISA检测在蛋白水平上证实了相关炎症因子的变化。结论:1、CXCL10参与烟曲霉菌性角膜炎的炎症反应。2、CXCL10可促进炎症细胞向感染角膜组织中的浸润,并引起促炎症因子的高表达发挥作用。3、CXCL10的调控在烟曲霉菌引起的真菌性角膜炎相关的炎症反应中起重要作用,有望成为临床上诊断和治疗的新靶点。