【摘 要】
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微孢子虫是一类可以感染脊椎动物和无脊椎动物的专性细胞内寄生的生物,分布广泛,种类繁多。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis,Nb）通过感染家蚕（Bombyx mori）引起微粒子病（P?brine disease）,是蚕业生产的重大威胁。SUMO化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,广泛参与了转录调控、免疫调节、细胞凋亡、染色体分离和信号转导等生物学过程。有研究显示SUMO修饰与一些真
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微孢子虫是一类可以感染脊椎动物和无脊椎动物的专性细胞内寄生的生物,分布广泛,种类繁多。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis,Nb）通过感染家蚕（Bombyx mori）引起微粒子病（P?brine disease）,是蚕业生产的重大威胁。SUMO化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,广泛参与了转录调控、免疫调节、细胞凋亡、染色体分离和信号转导等生物学过程。有研究显示SUMO修饰与一些真菌的侵染过程和毒力有关,但是关于微孢子虫编码的SUMO化修饰相关基因的功能尚未见报道。本研究克隆了家蚕微孢子虫2个SUMO化修饰相关基因Nb SUMO和Nb Ubc9,初步分析了它们的特征和在Nb感染中的作用。主要内容如下:（1）Nb SUMO长度为279 bp,含有93个氨基酸,蛋白分子质量约为10.25 KDa。其氨基酸序列与人的SUMO1-4的相似度比较低,只有27-29%的相似度,与其宿主家蚕的SUMO序列相似度也只有34%。Nb Ubc9基因全长468 bp,含有156个氨基酸,分子质量约为17.2KDa。氨基酸序列与同为微孢子虫Nosema属的Nosema apis（西方蜜蜂微粒子虫）和Nosema ceranae（东方蜜蜂微粒子虫）同源性最高（分别为56%和52%）,而与其宿主家蚕Ubc9的相似性只有32%。构建的进化树结果显示,Nb SUMO和Nb Ubc9与所有来源于微孢子虫属的同源基因聚类在同样的大分支上,进化上的高度保守性暗示它们可以作为微孢子虫的分类依据。（2）使用q RT-PCR分别检测了家蚕和Nb的SUMO、Ubc9基因在Nb感染家蚕后在家蚕中肠组织中的变化情况,发现Nb自身表达的Nb SUMO和Nb Ubc9显著增加,而家蚕内源性SUMO和Ubc9的表达量在Nb感染后没有显著变化,甚至稍有减少,表示家蚕微孢子虫主要利用自身表达的SUMO分子来调节宿主和自身的蛋白功能。（3）利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达载体系统构建了重组杆状病毒v BmEGFP-Nb SUMO和v BmEGFP-Nb Ubc9,通过观察融合表达蛋白荧光在细胞内的位置发现Nb SUMO和Nb Ubc9蛋白质在Bm N细胞的细胞质和细胞核之中都有分布,但是主要在细胞质中呈聚集性点状分布。利用PULL-DOWN及LC/MS/MS质谱分析技术,筛选出有65个家蚕蛋白和10个Nb蛋白可能被Nb SUMO结合,46个家蚕蛋白和9个Nb蛋白可能被Nb Ubc9结合。Gene Ontology分析发现Nb SUMO结合蛋白质参与了泛素化修饰、转录调控、DNA复制等过程,Nb Ubc9结合蛋白主要涉及了信号转导、翻译、蛋白质折叠与转运、去泛素化等功能。（4）为初步研究家蚕微孢子虫SUMO修饰系统对宿主蛋白的翻译后调控机制,分别用抑制剂和si RNA阻断SUMO途径,观察对Nb复制的影响,结果显示抑制剂（ML-792和2-D08）使细胞中Nb产量分别减少了40%和23%。RNAi敲降Nb SUMO后,Nb基因组拷贝数显著降低,表明Nb SUMO对家蚕微孢子虫的复制至关重要。（5）最后构建稳定表达Nb SUMO蛋白的Bm N细胞系,用RNA-seq技术检测过量表达Nb SUMO的条件下宿主细胞内基因表达情况,发现Nb SUMO过表达之后家蚕Bm N细胞内基因表达变化明显,共3628个显著差异表达基因,其中3065个上调,563个下调。GO富集分析结果发现差异表达基因参与细胞内过程、生物调节、代谢过程、生物过程的调节、定位、刺激反应等生物过程,分子功能主要包括结合、催化活性、转运活性、分子调节器等。对差异基因KEGG通路分析表明显著差异表达基因与Wnt信号通路、氧化磷酸化、细胞衰老等有关。综上所述,通过对Nb SUMO、Nb Ubc9的基因特征进行分析,互作蛋白筛选,基因敲降等手段,我们的研究初步证明家蚕微孢子虫SUMO化修饰系统在其感染中起了重要作用,但其具体机制还需要进一步的深入研究。
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