目的：呼吸道病毒所引起的呼吸道感染是疾病死亡的主要原因之一。近年来,由呼吸道病毒引起的疫情暴发流行也在逐渐增多,如甲型H1N1流感病毒、腺病毒及近来暴发的H7N9流感病毒等疫情,给人类健康带来了很大的危害。这些呼吸道病毒大都具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点,所引发的疾病及疫情的病原学复杂,快速精确的检测鉴定病原体不仅可以为疾病诊断治疗提供充足的依据,也可以为疫情防控提供坚实的基础。因此,寻找一种快速有效检测呼吸道病毒的方法是非常必要的。传统检验方法如病毒分离培养、免疫学检测等方法检测周期长,操作繁琐不适应推广使用,而现代分子生物学检测技术如荧光定量PCR、毛细管电泳检测等方法虽然一定程度上提高了检测的效率,缩短了操作的周期,但也由于各自技术的弊端不能同时检测多种靶病毒。而基因芯片技术由于可以快速、高通量、平行化的检测多个靶基因片段在病毒检测领域有独特的优势。本课题的研究目的是以基因芯片技术为基础,针对八种常见呼吸道病毒,建立一种快速、灵敏、特异、高通量检测方法。为呼吸道病毒的鉴定提供实验依据,并为感染病例临床诊断、卫生监督、疫情防控等提供快速、有效的诊断手段。方法：本课题选取八种常见呼吸道病毒作为待测靶病毒,设计筛选引物探针、探讨核酸提取方法、策划多重RT-PCR扩增组合、优化杂交体系,建立了以基因芯片技术为基础的呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法,并利用正交实验及对比法对检测方法中的多重RT-PCR扩增、杂交等步骤的参数进行了优化,确定芯片的最佳检测条件并建立芯片的判读标准。对所建立的检测方法从特异性、灵敏度及重复性三个方面进行了评价：根据所建立的检测方法是否可以对八种常见的呼吸道病毒进行准确检测,评价检测方法的特异性；根据可检测到核酸拷贝数的下限,评价检测方法的灵敏度；根据片间片内杂交信号值的变异系数来判定检测方法是否稳定可靠,评价检测方法的重复性。最后,本实验利用所建立的检测方法对262份临床样本进行了检测,考察的检测方法实际应用能力。结果：(1)本课题建立了常见呼吸道病毒检测的方法,可以对人类偏肺病毒,呼吸道合胞体病毒,甲型流感病毒,乙型流感病毒,副流感病毒I型,副流感病毒II型,副流感病毒III型,腺病毒八种呼吸道病毒病毒进行筛查。设计筛选包括副流感病毒通用引物在内的六对特异性引物,及八条特异性探针。同时设立了内标对照探针,对检测过程进行监测。(2)探讨了呼吸道病毒核酸的提取方法,选择了适合本检测方法使用的自动化提取系统磁珠提取法。(3)确定了RT-PCR反应的最佳条件,反转录酶和热启动聚合酶的用量分别为0.35μL及1.25μL,未标记引物与生物素标记引物的比例间为1：5,引物浓度为0.2μM:1μM,两管中各病毒引物的浓度比分别为2：2：1：1：1及2：2：1；RT-PCR反应的最终退火温度为52℃。(4)优化了杂交液的成分及杂交温度。杂交液最佳组分组合为5×SSC、0.8%SDS、2.5%甲酰胺。最佳的杂交温度为45℃。并最终确定了各呼吸道病毒探针的Cutoff值及判读标准。(5)检测方法特异性评价的结果显示,阳性毒株杂交信号值远大于各自对应探针的Cutoff值,阴性毒株及空白对照的杂交信号值均小于各探针Cutoff值,说明所建立的检测方法的特异性很好,可以对八种常见的呼吸道病毒进行准确检测。(6)灵敏度评价的结果显示,该检测方法可以检测出不低于102CFU/mL的体外转录RNA,检测灵敏度较荧光显色检测法提高100倍。(7)重复性评价的结果显示,片间和片内变异系数均小于15%,说明本课题建立的基因芯片检测呼吸道病毒方法稳定、可靠。(8)对262份临床样本进行了检测结果显示,所建立的检测法检测的准确率为96.9%(254/262)。表明该方法能有效的鉴定临床样本中感染的病原体,并可以对呼吸道病毒混合感染病例进行诊断。结论：本实验建立了一种以基因芯片技术为基础、量子点标记银染显色为创新的检测八种常见呼吸道病毒的方法,具有高通量、快速、特异性好、灵敏度高等特点。可以同时对多种病原体进行检测鉴定,且检测结果可以通过可视化信号判别,操作简便快速,可用于临床呼吸道病毒单病毒感染或混合感染病例的诊断,并有利于卫生监督、控制相关病毒传播途径从而预防疫情爆发。