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目的:本课题应用双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导C57BL/6小鼠,建立不同时间的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)脱髓鞘模型。观察不同CPZ喂食时间小鼠的髓鞘脱失情况、免疫反应及胶质细胞反应的时空变化。试图找到理想的药物干预靶点,为髓鞘再生和脱髓鞘疾病的神经保护提供理论和实验依据。方法:本实验采用8周龄C57BL/6雄性小鼠,建立CPZ喂食诱导的小鼠脱髓鞘模型。小鼠分为对照组、2周组、4周组、6周组,每组8只小鼠。正常组常规啮齿动物标准饲料,连续饲喂6周;2周组常规啮齿动物标准饲料先饲喂4周,然后继续饲喂含0.2%(w/w)CPZ的混合饲料2周;4周组常规啮齿动物标准饲料先饲喂2周,然后继续饲喂含0.2%(w/w)CPZ的混合饲料4周;6周组含0.2%(w/w)CPZ的混合饲料,连续饲喂6周。并从造模开始记录动物的体重。在第六周结束时处死动物,取脾脏、脑组织,分离脾脏单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),将脑组织分为提取蛋白质和固定两部分。进行Luxol Fast Blue染色、Black Gold II染色、MBP免疫荧光染色观察髓鞘形态及脱失程度;Western blot法检测MBP的表达;Elisa法测定脾细胞培养上清及脑内相关细胞因子的释放;免疫荧光染色观察免疫细胞及胶质细胞的变化。各组实验数据应用GraphPad Prism 7.0进行统计分析。结果:(1)小鼠脑胼胝体Luxol Fast Blue染色(对照组胼胝体平均光密度为0.4855±0.0006766;2周组为0.3964±0.006159,p<0.0001;4周组为0.1146±0.007348,p<0.0001;6周组为0.07621±0.00228,p<0.01,相邻两组比较有统计学意义)、Black Gold II染色(对照组胼胝体平均光密度为0.459±0.002406;2周组为0.4242±0.004816,p<0.05;4周组为0.2057±0.01395,p<0.0001;6周组为0.1676±0.002224,p<0.01,相邻两组比较有统计学意义)、MBP免疫荧光染色(对照组胼胝体平均光密度为0.1228±0.006121;2周组为0.1076±0.003484,p<0.01;4周组为0.09098±0.0003428,p<0.01;6周组为0.07569±0.001767,p<0.01,相邻两组比较有统计学意义)均可见,随着CPZ喂养时间的延长,髓鞘脱失逐渐加重,并在CPZ喂养4-6周建立稳定的脱髓鞘模型.(2)免疫荧光染色检测脑内血管内皮细胞ZO-1~+的表达情况。结果显示,与对照组相比,CPZ喂食随时间延长,血管内皮细胞ZO-1~+表达逐渐降低,同时,血管内皮细胞也缺乏血管特征。对照组ZO-1~+细胞数为(43.33±0.8819),2周组为(30±1.528,p<0.001),4周组为(19.67±0.8819,p<0.01),6周组为(15.67±1.202,p<0.01),相邻两组比较有统计学意义。(3)免疫荧光染色检测脑内CD4~+T细胞的表达情况以及状态。结果显示,与对照组相比,用CPZ喂食的小鼠的侧中隔核背侧CD4~+T细胞的浸润显著增加,并随CPZ喂食时间的延长而增加。对照组CD4~+T细胞数为(0.3333±0.3333),2周组为(4.333±0.3333,p<0.001),4周组为(8.333±0.3333,p<0.001),6周组为(11.33±0.3333,p<0.001),相邻两组比较有统计学意义。另外,随着CPZ喂食时间的延长,大脑中CD4~+IL-17~+和CD4~+IFN-γ~+T细胞的数量增加。CD4~+IL-17~+细胞数对照组为(0.3333±0.3333),2周组为(2.667±0.3333,p<0.05),4周组为(6±0.5774,p<0.01),6周组为(9±0.5774,p<0.01),相邻两组比较有统计学意义。CD4~+IFN-γ~+细胞数对照组为(0.3333±0.3333),2周组为(3.333±0.3333,p<0.01),4周组为(5.333±0.3333,p<0.05),6周组为(7±0.5774),相邻两组比较有统计学意义。同时用Elisa检测脑组织提取液中IL-17和IFN-γ的水平也与免疫荧光的结果相匹配。CPZ喂食导致脑内IL-17和IFN-γ的浓度升高,并在4-6周达到峰值,CPZ喂食2周后无显著差异,这与免疫荧光的结果基本一致。IL-17对照组水平为(1435±301.3),6周组为(3762±746.7,p<0.05),与对照组相比有统计学意义。IFN-γ对照组水平为(1398±343.7),4周组为(4526±1097,p<0.05),与对照组相比有统计学意义。(4)Elisa检测脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-17、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的浓度。结果显示,与对照组相比,CPZ喂食2周后,培养的脾细胞上清中的IFN-γ和IL-17含量略有升高,但无统计学意义。出乎意料的是,与CPZ喂食2周的小鼠相比,CPZ喂食4周和6周后,IFN-γ和IL-17明显降低(分别为p<0.01和p<0.0001)。此外,在CPZ进食2周后,IL-1β略有增加,而在CPZ暴露4-6周后,培养的脾细胞上清液中TNF-α和IL-6明显升高(分别为p<0.01和p<0.0001),CPZ喂养不会改变IL-10的浓度。(5)免疫荧光染色检测脑内Iba1~+小胶质细胞和Iba1~+ICAM-1~+的表达情况。结果显示,与对照组相比,CPZ喂食导致Iba1~+小胶质细胞和Iba1~+ICAM-1~+被大量激活,并随着CPZ喂食时间延长而增加表达。(6)免疫荧光染色检测脑内GFAP~+星型胶质细胞和GFAP~+SOX2~+的表达情况。结果显示,与对照组相比,CPZ喂食导致GFAP~+星型胶质细胞和GFAP~+SOX2~+被大量激活,并随着CPZ喂食时间延长而增加表达。另外,免疫荧光染色还检测脑内GFAP~+BDNF~+、GFAP~+CNTF~+和GFAP~+IGF-II~+的表达情况,与对照组相比,CPZ喂食增加了星型胶质细胞的BDNF、CNTF和IGF-II的表达,并随着CPZ喂食时间延长而增加表达。(7)免疫荧光染色检测脑内NG2~+、PDGF-Rα~+、Olig2~+OPCs和PDGF-Rα~+SOX2~+的表达情况。结果显示,与对照组相比,CPZ喂养NG2~+、PDGF-Rα~+和Olig2~+OPCs大量激活,Olig2逐渐向胼胝体迁移。对照组相比,PDGF-Rα~+SOX2~+OPCs显著下降,表明表达SOX2的OPCs生成成熟的少突胶质细胞能力不足(分别为p<0.001和p<0.0001)。结论:(1)喂食2周后,CPZ不会引起明显的小胶质细胞反应,但是喂食4周后,CPZ导致明显的小胶质细胞向髓鞘迁移和积累。脑组织提取液中炎性细胞因子IL-1β和IL-6的产生增加,表明脑中有小胶质细胞介导的炎性微环境,这应有助于BBB破坏和T细胞侵袭。(2)CPZ喂食引起星形胶质细胞活化并上调BDNF,CNTF和IGF-II的表达,从而为髓鞘再生或神经保护提供了神经营养性微环境。(3)在CPZ喂食的第4周和第6周,小胶质细胞介导的炎症微环境与星形胶质细胞驱动的神经营养性微环境共存。我们推测星形胶质细胞来源的BDNF,CNTF和IGF-II可以诱导NG2~+和PDGF-Rα~+OPCs的生成,但是由小胶质细胞介导的神经炎性微环境可能影响OPCs分化为成熟的髓鞘。