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研究背景癌症仍然是人类健康的重大威胁,传统的癌症治疗手段包括手术、化疗、放疗和免疫治疗等虽然在一定程度上缓解了病人的肿瘤负担,但却面临着副作用大、靶向性差、多药耐药、肿瘤易复发等问题。随着纳米生物医学的蓬勃发展,越来越多的纳米药物(Nanomedicine)被开发用于肿瘤的诊断和治疗。纳米药物具有多种优势,包括靶向递送、可控释放、刺激响应、功能集成等,这些优势使纳米药物在降低传统药物毒性,提高靶向性,改善多药耐药等问题中表现出巨大潜力。纳米药物的重要成分之一是纳米材料,小分子药物通过共价/非共价修饰或物理包载的方式负载在纳米材料上得到纳米药物。纳米药物可以通过载体来修饰靶向分子,体内行为优化分子,治疗性药物或基因,成像剂,刺激响应模块等实现纳米药物的功能优化,达到减毒增效的治疗效果。在众多用于构建纳米药物的无机和有机纳米材料中,类黑纳米材料由于出色的理化性质受到越来越多的关注。天然黑色素根据来源可分为真黑素、非黑素、神经黑素、异源黑素和原核黑素。从墨鱼墨汁中提取的生物合成的真黑素颗粒的主要成分包括5,6-二羟基吲哚(DHI)和5,6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)。通过超速离心法从墨鱼墨汁中分离的天然纳米粒子与体外合成的聚多巴胺(PDA)纳米粒子因为与真黑素具有相似的理化性质被称为类黑纳米粒子(MNPs)。类黑纳米粒子由于获取途径简单,表面易修饰,光学性质突出,生物相容性良好等优势在药物递送、体内成像以及肿瘤光热治疗等研究领域受到广泛关注。肿瘤光热治疗(PTT)作为一种非侵入式治疗方式具有副作用小、精准控制等优势。纳米材料介导的肿瘤光热治疗也获得越来越多的关注,但光热转换剂(PCAs)在肿瘤组织中的不均匀分布会导致深层肿瘤细胞的存活,最终导致肿瘤组织的不完全消融。此外光热消融肿瘤细胞诱导的炎症招募大量肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤部位,这加重了肿瘤的免疫抑制负担,进一步促进了肿瘤的复发和转移。近些年,类黑纳米材料由于出色的光热性能和生物相容性在肿瘤光热治疗领域得到广泛研究。针对上述科学背景和肿瘤光热治疗中面临的科学问题,本研究主要构建了两种不同功能化的类黑纳米体系来实现高效的肿瘤治疗:1)黑色素类黑纳米粒子的功能化及其在肿瘤光热-化疗中的应用研究;2)聚多巴胺类黑纳米粒子的功能化及其在肿瘤光热-免疫治疗中的应用研究。该研究从肿瘤光热治疗面临的科学问题入手,设计不同功能化的类黑纳米体系来增强肿瘤治疗效果,为肿瘤光热协同其他疗法的联合治疗策略提供了参考模式,也为类黑纳米体系的功能化设计以克服肿瘤治疗中的困境提供新的设计思路。第一部分黑色素类黑纳米粒子的功能化及其在肿瘤光热-化疗中的应用研究研究目的本部分研究针对PCAs分布不均导致光热效应对肿瘤深层细胞杀伤有限的问题,设计级联响应药物释放的尺寸变化黑色素类黑纳米粒子用于肿瘤光热-化疗联合治疗。该纳米体系通过超小尺寸类黑纳米粒子负载阿霉素后用温敏脂质体(TSL)包裹,具有近红外光(NIR)和肿瘤微环境级联响应的药物释放能力,同时满足体内循环和肿瘤组织渗透对纳米粒子尺寸的矛盾需求。在该设计中,大尺寸的纳米粒子通过增强的渗透与保留(EPR)效应在肿瘤部位富集,在接受NIR照射时,局部温度上升消融部分肿瘤细胞的同时严重破坏TSL结构,小尺寸的载药纳米粒子和DOX进一步响应释放并渗透到肿瘤组织深层杀伤肿瘤细胞,该尺寸可变的级联药物释放设计旨在增强肿瘤治疗效果。实验方法1.类黑纳米体系的制备与表征通过将块状黑色素溶解后控制其氧化聚合获得水溶性的超小类黑纳米粒子,类黑纳米粒子负载阿霉素(DOX)后和温敏脂质薄膜共挤出制得最终的纳米体系MNP/DOX@TSL。透射电镜(TEM)表征纳米粒子的形貌;动态光散射仪(DLS)表征纳米粒子的水合粒径和Zeta电位;紫外-可见分光光度计表征紫外-可见吸收光谱;荧光分光光度计表征荧光发射光谱;红外热成像仪记录NIR照射下纳米粒子的温度变化。2.类黑纳米体系的体内外渗透能力研究分别研究纳米粒子接受近红外光照射前后,在模拟细胞外基质、3D肿瘤细胞球和体内肿瘤组织中的渗透能力。体内实验操作如下:构建4T1荷瘤小鼠模型,当肿瘤体积达到100 mm~3时,分别尾静脉注射MNP/DOX或MNP/DOX@TSL纳米粒子(10 mg/kg),注射后12 h,小鼠肿瘤部位根据需要接受NIR照射5 min,收集肿瘤组织,切片、染色后使用共聚焦显微镜观察。3.类黑纳米体系的体内代谢和光热效应健康的Balb/c雌性小鼠(6-8周龄)静脉注射PBS,游离Cy5.5,MNP/Cy5.5或者MNP/Cy5.5@TSL NPs(10 mg/Kg)。静脉给药后的不同时间点(1、2、4、6、8、12 h)通过尾尖静脉获取血液样本,并使用荧光成像系统分析样品的荧光强度。4T1荷瘤小鼠被用来研究MNP/Cy5.5@TSL NPs的生物分布。当肿瘤体积到达100 mm3时,小鼠尾静脉注射不同制剂,并在注射12h后实施安乐死。分别收集主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织,使用荧光成像系统获得离体荧光图像并分析样品相对荧光强度。为了研究纳米粒子的体内光热效应,荷瘤小鼠分别尾静脉注射PBS、MNP@TSL和MNP/DOX@TSL(10 mg/kg),给药12 h后,小鼠肿瘤部位暴露于808 nm激光(2 W/cm~2,5 min),并用红外热成像仪记录局部温度变化和拍照。4.体内抗肿瘤效应评价荷瘤小鼠肿瘤体积约为100 mm~3时,小鼠随机分为5组:对照组(PBS)、MNP@TSL、MNP@TSL+NIR、MNP/DOX@TSL和MNP/DOX@TSL+NIR组。小鼠分别于第0,3和6天静脉注射纳米粒子,激光组小鼠在麻醉后将肿瘤部位暴露于808 nm激光(2 W/cm~2)下照射5 min。治疗实验持续16天,整个实验过程中每两天使用游标卡尺监测肿瘤体积的变化,根据以下公式计算肿瘤体积(V):V=(长度×宽度~2)/2,每两天监测小鼠体重,实验结束时,收集肿瘤称重并拍照。实验结果1.类黑纳米体系的制备与表征TEM结果显示,我们合成了水分散性良好的类黑纳米粒子,尺寸约为3.7nm,载药和挤出后,MNP/DOX@TSL呈现球形且内部有明显的黑色点状颗粒,尺寸约为83 nm,这与DLS结果一致。紫外-可见光吸收光谱显示载药后,纳米粒子在254 nm和480 nm处出现了DOX的特征吸收峰,表明药物负载成功。荧光发射光谱结果得到相似的结论。2.类黑纳米体系的体内外渗透能力研究体外实验结果显示,MNP/DOX@TSL在模拟细胞外基质中的渗透深度有限,而且DOX荧光强度较弱,NIR照射后,纳米粒子的荧光信号分布和强度都有明显提高,这与小粒径的MNP/DOX渗透结果相似,说明NIR照射破坏了TSL的结构完整性,释放出的小尺寸载药纳米粒子具有更好的渗透能力。3D细胞球中的渗透结果显示,NIR照射后,纳米粒子在细胞球中的荧光信号分布更接近细胞球中心,且荧光强度更强。体内肿瘤组织切片结果显示,MNP/DOX@TSL组的DOX荧光信号分布主要集中在边缘而激光照射后的DOX荧光信号渗透更深,强度也更强。上述结果说明这种的尺寸可切换纳米体系能实现药物在肿瘤组织中深层渗透。3.类黑纳米体系的体内代谢和光热效应体内代谢实验结果表明,TSL的包裹明显延长了类黑纳米粒子的体内循环时间。MNP/Cy5.5组在静脉给药后8 h,血液中几乎检测不到Cy5.5荧光信号,而MNP/Cy5.5@TSL在注射后12 h仍可检测到明显的荧光信号。体内光热效应结果显示,静脉注射MNP/DOX@TSL纳米粒子12h后,激光照射5 min,肿瘤局部温度可升高至52℃,说明纳米体系在体内具有良好的光热转化效应。4.体内抗肿瘤效应评价实验结果表明,MNP/DOX@TSL+NIR组具有最佳的肿瘤生长抑制效果,显著延缓了肿瘤生长,肿瘤抑制率可达74%,远高于单独的光热治疗组(16%)和单独的化疗组(27%)。治疗期间小鼠体重与对照组相比没有明显变化说明纳米体系不会造成严重的全身毒性,生物安全性良好。结论本课题成功构建了级联药物释放的尺寸可切换类黑纳米系统MNP/DOX@TSL实现光热治疗联合深层肿瘤的化疗。该设计在实现体内长循环的同时能够明显提高纳米药物在肿瘤组织中的渗透能力,最终显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,实现强大的抗肿瘤效果。第二部分聚多巴胺类黑纳米粒子的功能化及其在肿瘤光热-免疫治疗中的应用研究研究目的光热治疗引起的局部持续性炎症通过招募大量肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)加重了肿瘤微环境免疫抑制负担,促进了残存的肿瘤细胞存活,进而阻碍抗肿瘤治疗。本部分工作设计了一种多功能聚多巴胺类黑纳米粒子用于重塑PTT后的肿瘤免疫微环境,通过光热协同免疫治疗实现强大的抗肿瘤效应。聚多巴胺类黑纳米粒子负载TMP195小分子后与巨噬细胞膜通过脂质体挤出器共挤出得到最终的P/T@MM纳米粒子。巨噬细胞膜赋予纳米粒子体内长循环和炎症靶向能力,TMP195通过影响单核巨噬细胞的表观遗传特征将TAMs的表型从免疫抑制的M2型再极化为抗肿瘤的M1表型,PDA同时作为药物载体和PCAs。这种三重多功能(包括仿生炎症靶向、TAMs表型再极化和光热转换)的类黑纳米系统能够重塑PTT后的免疫抑制微环境并有望实现优异的联合抗肿瘤功效。实验方法1.P/T@MM纳米粒子的合成与表征通过多巴胺的氧化自聚合制备聚多巴胺纳米粒子,通过非共价键吸附TMP195小分子,之后载药纳米粒子与巨噬细胞膜通过脂质体挤出器共挤出获得巨噬细胞膜涂层。纳米粒子分别用TEM、DLS、紫外-可见分光光度计表征形貌、水合粒径和Zeta电位、紫外可见吸收光谱。2.P/T@MM纳米粒子的光热效应和体外再极化TAMs表型使用红外热成像仪记录纳米粒子在808 nm的激光照射下的温度随时间变化,分别研究光热效应与纳米粒子浓度、激光功率、激光照射时间的关系并计算光热转换效率。通过细胞与不同浓度的纳米载体孵育考查纳米载体的细胞毒性;4T1细胞与100μg/m L的PDA孵育后接受808 nm激光照射10 min,检测细胞活力以评价纳米系统的光热毒性。RAW264.7细胞先与IL-4共孵育诱导其向M2表型分化,之后与不同的纳米粒孵育24 h后,使用流式细胞仪检测M2表型巨噬细胞的比例,使用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养上清中相关炎症因子的分泌水平。3.PTT后肿瘤局部炎症效应和P/T@MM炎症靶向研究使用4T1荷瘤小鼠模型评价PTT后肿瘤局部炎症效应:当肿瘤体积达到100 mm~3时,荷瘤小鼠分别尾静脉注射PBS或者P@MM NPs(10 mg/kg)。之后荷瘤小鼠被随机分为三组:PBS组、P@MM组和P@MM+NIR组,每组15只小鼠。激光组小鼠在静脉注射纳米粒子12h后,使用808 nm激光照射肿瘤部位10 min(1.6 W/cm~2)。在预定时间点(6、12、24、48、72h)给小鼠实施安乐死并收集肿瘤,称取相同质量的肿瘤研磨后用多因子检测试剂盒检测组织匀浆中炎症因子水平。按照制备P/T@MM的方法,将近红外荧光染料Cy5.5载入载体中,得到P/Cy5.5@MM NPs。当肿瘤体积达到100 mm~3时,荷瘤小鼠尾静脉注射P@MM NPs(10 mg/kg),12h后用808 nm激光照射肿瘤部位10 min。小鼠被随机分为三组并在激光照射24h后分别尾静脉注射游离Cy5.5,P/Cy5.5@Lip和P/Cy5.5@MM NPs(1 mg Cy5.5/kg)。分别在注射后2、6、12、24和48h分析小鼠活体荧光信号。静脉注射6h后收集主要器官(心、肝、脾、肺和肾)和肿瘤组织用于离体荧光分析。4.P/T@MM体内抗肿瘤效应评价4T1荷瘤小鼠随机分为5组,分别为:PBS+NIR组、P@MM+NIR组、P/T@Lip+NIR组、P/T@MM组和P/T@MM+NIR组。在肿瘤接种后第5天当肿瘤体积接近100 mm~3时,小鼠第一次给药,TMP195和PDA的给药量分别为736μg/kg和10 mg/kg,三天后再次给药,一共给药两次。激光组在给药12 h后使用808 nm激光(1.6 W/cm~2)照射肿瘤部位10 min。每隔一天记录肿瘤体积和小鼠体重,在治疗结束时收集小鼠血液和肿瘤组织用于进一步分析。收集的肿瘤组织经过消化研磨并用筛网过滤得到单细胞悬液,经流式抗体染色后用流式细胞仪分析瘤内浸润M1型TAMs(F4/80+CD80+)、M2型TAMs(F4/80+CD206+)、细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)、调节性T细胞(CD3+CD4+CD25+)、骨髓来源性抑制细胞(CD11b+Gr1+)的比例。实验结果1.P/T@MM纳米粒子的合成与表征透射电镜结果显示,合成的PDA呈现球形且分散性良好,负载TMP195后纳米粒子形貌没有明显变化,巨噬细胞膜包裹后,P/T@MM纳米粒子呈现厚度5-10 nm的涂层,提示巨噬细胞膜覆盖成功。DLS结果显示PDA纳米粒子的水合粒径约为115 nm,P/T@MM NPs的水合粒径增加到160 nm,且其Zeta电位与巨噬细胞膜囊泡接近约为-20 m V。紫外-可见吸收光谱显示,P/T@MM在550-900 nm范围内有宽泛的吸收。2.P/T@MM纳米粒子的光热效应和体外再极化TAMs表型细胞毒性结果表明,纳米载体的浓度高达200μg/m L时细胞活力仍高于80%,说明载体具有良好的细胞安全性。100μg/m L纳米粒子与4T1细胞孵育后用激光照射,细胞活力降低至10%以下,说明纳米体系具有良好的细胞光热毒性。纳米系统的光热效应与载体浓度、激光功率和照射时间在一定范围内呈现正相关。流式结果显示,P/T@MM NPs孵育后,M2表型巨噬细胞的比例从57.2%下降至31.4%,ELISA结果表明,细胞培养上清中M1表型相关炎症因子IL6分泌增多,M2表型相关炎症因子IL10分泌下降。这些结果证明P/T@MM纳米粒子在体外能够显著地将巨噬细胞表型从M2再极化为M1。3.PTT后肿瘤局部炎症效应和P/T@MM炎症靶向研究肿瘤局部炎症因子的检测结果表明,光热治疗后6-72小时内,多种炎症因子维持在较高水平,其中半胱氨酸-半胱氨酸基序趋化因子配体2(c-c motif chemokine ligand 2,CCL-2)在巨噬细胞招募过程中起着重要作用,从分析图中可以看出CCL-2的浓度在24h时达到峰值,24-48h内有所下降但仍高于对照组。此外,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)的水平在光热治疗后的6-72h内持续升高。这些结果表明,光热治疗后的炎症效应导致多种炎症因子分泌升高。P/T@MM的炎症靶向效应结果显示,巨噬细胞膜涂层的纳米粒子在肿瘤部位富集最多,且在6h时荧光信号最强。收集此时的肿瘤组织进行离体荧光成像,结果显示,巨噬细胞膜包裹的纳米粒子荧光信号明显高于其他组,说明巨噬细胞膜涂层在体内能够实现炎症介导的肿瘤靶向作用。4.P/T@MM体内抗肿瘤效应评价小鼠肿瘤生长曲线结果显示,在监测的17天内,对照组(PBS+NIR)的肿瘤体积增长迅速,而单独的PTT组(P@MM+NIR)肿瘤体积增长在前期得到抑制,停止给药后肿瘤体积增长显著。相比之下,PTT协同TAMs再极化的治疗(P/T@MM+NIR)明显抑制了肿瘤体积的增长,肿瘤清除率达到60%,远高于单独的PTT组(10%),说明PTT联合TAMs复极化的策略具有最佳的治疗效果。肿瘤浸润免疫细胞分析结果进一步表明,治疗结束时单独光热治疗组的M2型TAM比例较对照组明显升高,最终治疗组的M2型TAMs显著降低,且M1/M2型TAMs的比例明显升高,值得注意的是,最终治疗组的T细胞浸润比例明显升高,一些免疫抑制细胞如调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg),骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)等比例则降低。这些结果说明P/T@MM纳米体系能重塑PTT后的免疫抑制微环境这有助于细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)杀伤肿瘤细胞。结论成功构建了具有炎症靶向的仿生类黑纳米粒子(P/T@MM),通过重塑肿瘤免疫抑制微环境,实现肿瘤的光热-免疫联合治疗。体内外实验表明,P/T@MM能显著地将TAMs的表型从免疫抑制的M2型再极化为抗肿瘤的M1表型,在体内表现出强大的协同抗肿瘤效应。