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20-羟基蜕皮甾酮(20-Hydroxyecdysone,20E)是蜕皮类固醇激素中的一员,能够促进干细胞的增殖和分化。人牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSC)来源于人牙周膜细胞(Periodontal ligament cells, PDLC),具有间充质干细胞的特性,然而,目前关于20E对PDLSC作用的研究却较少。目的：讨论应用组织块法、酶消化法、酶解组织块法体外分离培养人PDLC的优缺点；研究PDLSC的体外分离、鉴定和诱导分化；研究20E在体外对PDLSC增殖、ALP(碱性磷酸酶)活性和成骨分化的作用。方法：1、分别应用组织块法、酶消化法、酶解组织块法培养PDLC。应用有限稀释法克隆化培养、分离纯化得到PDLSC;为描述单克隆得到的PDLSC的干细胞表型标记,应用流式细胞技术检测细胞表面标志物STRO-1、CD146和CD45的表达；为检测PDLSC的多向分化能力,应用成骨诱导液、成脂诱导液诱导PDLSC成骨、成脂分化。2、将PDLSC以4×103个/m1的浓度,每孔200ul,接种于96孔板培养。培养24h以后,弃掉原来的培养液,分别加入含有0、50、100、200、400uM的20E的培养液,这些细胞随后再被培养1-10天。采用MTT法检测20E对PDLSC体外增殖能力的影响。最后,在酶联仪上检测吸光密度(0D)值。3、将细胞以2×104个细胞/cm2的密度接种,24h后弃培养液,用加入或不加入20E(50,100,200uM)的培养液培养细胞。7天后弃掉培养液,进行碱性磷酸酶染色。4、将PDLSC以4×105个/ml的浓度,每孔1ml,接种于6孔板培养。培养24h以后,弃掉原来的培养液,用含或不含20E(200uM)的培养液培养细胞。3天后应用real-time PCR分析RUNX2的表达。应用SPSS13.0软件分析以上数据,并用均数±标准差(x士SEM)表示。两个样本均数比较应用独立样本的t检验；多个样本的两两比较,先应用方差分析(ANOVA),再应用多样本两两比较中的SNK法进行比较,当P<0.05时,表示差异有统计学意义。结果：1、应用酶解组织块法分离培养PDLC的成功率为60%;应用组织块法分离培养PDLC的成功率为53%;应用酶消化法分离培养PDLC的成功率为40%。经流式细胞术检测,有限稀释法所得到的细胞表达的STRO-1、CD146较高,表达的CD45较少。PDLSC在体外成功进行成骨、成脂分化。2、第1天对照组与实验组各组0D值无统计学差异(P>0.05),2-10天各组间0D值有统计学差异(P<0.01),400uM组0D值低于对照组,低浓度组(50,100,200uM) OD值高于对照组,且OD值随20E浓度增高而增高。3、碱性磷酸酶染色阳性。4、3天后实验组和对照组RUNX2的mRNA表达有统计学差异(P<0.01),且实验组mRNA表达高于对照组。结论：1、原代培养人PDLC,酶解组织块法成功率最高；有限稀释法成功分离得到PDLSC; PDLSC有多向诱导分化能力。2、400uM的20E有细胞毒性,抑制PDLSC增殖,而低浓度的20E (50,100,200uM)促进PDLSC增殖,且具有剂量依赖性。3、20E促进PDLSC的ALP活性。4、20E促进PDLSC的成骨分化。