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目的:探讨健骨颗粒氯仿萃取部位通过BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路,对体外成骨细胞分化的影响。方法:1.药物的制备运用氯仿对健骨颗粒原方进行萃取,获得氯仿萃取溶液,经蒸发、干燥最终形成固体,得到健骨颗粒氯仿萃取部位。将充分干燥后的中药固体,用DMSO配置成30mg/ml的母液,分装后-20℃冻存备用。2.细胞干预与指标检测从BALB/c小鼠的乳鼠颅盖骨提取原代成骨细胞,取第三代细胞作为实验对象,设置健骨颗粒氯仿萃取部位不同药物浓度组(即0、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml、32ng/ml、64ng/ml药物浓度组),MTT实验检测各组细胞的增殖速度,选择药物的最佳干预浓度,作为后续实验的药物浓度。取第三代细胞,设空白对照组(加入含10%胎牛血清的完全培养基)、抑制剂组(加入含BMP抑制剂Noggin150ng/ml的完全培养基)、药物组(加入含健骨颗粒氯仿萃取部位最佳干预浓度的完全培养基)、抑制剂加药物组(加入含相应浓度Noggin与健骨颗粒氯仿萃取部位的完全培养基),分别进行相关干预;实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测细胞 BMP2、Smad1、Runx2、Osterix以及成骨细胞分化标志物ALP、Collagen Ⅰ mRNA的表达;蛋白印迹法(Westernblot,WB)检测细胞 BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、CollagenI、ALP 蛋白表达,观察药物对成骨细胞分化的影响。结果:1.原代成骨细胞分离培养情况用组织块法联合酶消化法,提取的成骨细胞数量多、纯度高、活性好,镜下可见细胞胞质丰富,增殖快速,经碱性磷酸酶染色后,可见细胞纯度在90%以上。2.最佳给药浓度的选择MTT实验结果显示:与空白对照组相比,健骨颗粒氯仿萃取部位各实验药物浓度组在干预第1d、2d时均可促进成骨细胞增殖,其中4～64ng/ml药物浓度组促增殖作用较明显(P<0.01);在药物浓度为32ng/ml时,成骨细胞增殖速度最快,在干预2d时达到增殖高峰,故后续实验以该药物浓度与时间进行细胞干预。3.相关指标mRNA与蛋白检测结果健骨颗粒氯仿萃取部位药物浓度选择MTT实验中的最佳干预浓度(32ng/ml),各组分别进行相关干预,干预2d时,RT-qPCR与Western blot检测成骨细胞各指标mRNA与蛋白的表达,实验结果显示:与空白对照组相比,药物组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP与Collagen Ⅰ mRNA与蛋白表达量均明显增高(P<0.01或P<0.05);抑制剂组六个指标mRNA与蛋白表达水平均明显降低(P<0.01或P<0.05)。与抑制剂组比较,抑制剂加药物组六个指标mRNA与蛋白表达水平均明显升高(P<0.01或P<0.05)。结论:1.运用酶消化法联合组织块法,在保证细胞活性的同时,可显著提高提取细胞的数量。2.健骨颗粒氯仿萃取部位可明显促进体外成骨细胞的分化,其促进作用与上调BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 通路关键信号分子 BMP2、Smad1、Runx2、OsterixmRNA与蛋白的表达密切相关。