论文部分内容阅读
植物病毒通过编码的移动蛋白(Movement protein,MP)与寄主蛋白相互作用完成移动和系统侵染。通过分析与MP互作的寄主蛋白在病毒移动和致病过程中的作用,可发现新的抗病毒靶标,提出可持续治理植物病毒病的新策略。P3NPIPO是马铃薯Y病毒属病毒的移动蛋白,但是与P3N-PIPO互作的寄主因子相关研究较少。本研究筛选到了马铃薯中与P3N-PIPO互作的细胞膜阳离子结合蛋白(PLASMA-MEMBRANE ASSOCIATED CATION-BINDING PROTEIN 1,PCaP1)。通过沉默和过表达研究发现,PCaP1的存在会促进马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒的细胞间移动。通过免疫共沉淀和体外Pull-Down验证了PCaP1与P3N-PIPO互作,并鉴定到二者互作的关键区域。结果如下:(1)筛选到马铃薯中与P3N-PIPO互作的寄主蛋白StPCaP1,该互作关系在番茄、马铃薯和普通烟中普遍存在。以TVBMV-P3N-PIPO为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选马铃薯cDNA文库。分析共鉴定出包含PCaP1在内的6个可能与TVBMV-P3N-PIPO进行相互作用的寄主蛋白。将PVY-P3N-PIPO和TVBMV-P3N-PIPO编码基因分别克隆到瞬时表达载体pCam-35S-EGFP;将马铃薯(StPCaP1)、普通烟(NtPCaP1)、番茄(SlPCaP1)编码基因序列分别克隆到瞬时表达载体pCam-35S-Myc。分别将不同病毒来源的P3N-PIPO和寄主来源的PCaP1在农杆菌中诱导表达后共浸润本氏烟。免疫共沉淀试验研究发现,TVBMV和PVY编码的P3N-PIPO均能与马铃薯、番茄和普通烟中的PCaP1互作,表明PCaP1是马铃薯Y病毒属病毒广谱的抗病靶标。(2)PCaP1参与两种马铃薯Y病毒属病毒的细胞间移动。在pCam-35SStPCaP1-Myc表达载体的基础上,获得了pCam-35S-Harpin-StPCaP1-Myc,利用RNAi技术对马铃薯中的PCaP1基因进行瞬时沉默。研究发现,沉默PCaP1的马铃薯中,TVBMV的细胞间移动受到了抑制,与PCaP1未发生沉默的马铃薯相比,紫外灯下观察到的TVBMV侵染点明显变小;PVY的系统发病所需的时间更长,上部叶片病毒积累水平降低。利用TRV VIGS对普通烟PCaP1基因进行沉默,沉默后接种TVBMV发现,侵染初期,沉默PCaP1的普通烟产生的侵染点要小于未沉默的普通烟;TVBMV的系统侵染受到抑制,上部叶片的病毒积累水平降低。在本氏烟超表达PCaP1对后期TVBMV的侵染无显著影响。以上结果表明,PCaP1参与两种马铃薯Y病毒属病毒的细胞间移动。(3)鉴定到PCaP1中间区域是决定PCaP1与P3N-PIPO互作的关键区域,第108位的丝氨是决定PCaP1与P3N-PIPO互作的关键位点。分别将TVBMV P3N-PIPO和StPCaP1进行原核表达,Pull-Down试验后发现两者在体外可以直接互作。通过分析PCaP1不同截短体与P3N-PIPO关系,明确定PCaP1与P3NPIPO互作的关键区域为105-120的氨基酸。丙氨酸扫描明确PCaP1第108位的丝氨酸是与P3N-PIPO互作的关键氨基酸。将第108位的丝氨酸按照单位点基因编辑的规则变为脯氨酸后丧失互作,该位点可作为培育马铃薯抗病毒植株的潜在基因编辑靶点。