DNA疫苗又叫核酸疫苗、基因疫苗，是将编码某种抗原的基因片段克隆到真核表达质粒，再用重组质粒DNA免疫动物。直接注射编码外源基因的裸DNA疫苗，该质粒可被吸收并表达相应蛋白，诱导出抗原特异性的细胞免疫和体液免疫。DNA疫苗能够激发免疫应答，有效防止病毒和细菌的感染、寄生虫、癌症及自身免疫性疾病，这一点已在许多动物模型中得以验证。在人体上的Ⅰ期临床试验已经显示试验性的DNA疫苗是安全、可耐受的，然而，同时也显示出在大多数情况下，这些DNA疫苗的免疫原性很低，而且在人类中还要比小鼠体内的免疫原性弱，这就说明有必要采取一些措施以提高疫苗的免疫原性。其中，方案之一即为共注射表达细胞因子的质粒作为基因佐剂。细胞因子作为免疫调节分子已在医学上得到了广泛的应用，并发挥着极其重要的抗病毒与抗肿瘤作用。虽然基因工程解决了细胞因子来源不足的问题，但直接的蛋白质用药，由于使用时所需的有效浓度过高，容易对机体产生剂量依赖性的毒性作用，而且还需要反复多次注射。如果将编码细胞因子的载体直接转移进机体，则细胞因子缓慢而持续地释放，可维持数周，又不会对机体产生上述的毒性作用。在对多种动物模型的研究中，可明确证实编码免疫调节作用的质粒DNA不仅能够改变可激发免疫反应的DNA疫苗的强度和方向，并且能够提高疫苗效能。这些研究表明，与DNA疫苗同时使用可调节免疫的细胞因子，可使临床医师能够更好的调整出合适的保护性免疫反应。近年来，许多学者的研究证实，双顺反子质粒载体使细胞因子或共刺激分子基因在同一细胞中表达，对于增强外源蛋白基因的免疫应答具有重要作用。双顺反子是将两个基因构建到同一质粒的同一个启动子的下游，多数情况下，下游的目的基因表达受限。因此，本实验选择构建共表达质粒，即将两个目的基因分别构建到同一质粒的不同启动子之后；并通过体外转染和体内接种，判断目的基因的表达情况、以及该共表达DNA疫苗的免疫疗效。本实验选用的抗原基因为人MAGE-A1（MAGE-1）。MAGE-1是MAGE家族成员中第一个<WP=92>被人们发现并认识的。目前已证实，MAGE-1在除睾丸和胎盘外的正常组织中不表达，而在黑色素瘤和其它多种恶性肿瘤中呈不同程度的表达。CTL通过识别MAGE-1基因的表达产物，可以特异性地识别并杀伤肿瘤细胞，为肿瘤的特异性免疫治疗开辟了一条新途径。MAGE-1全长4.5kb，由3个外显子组成，氨基酸编码序列全部位于第三外显子。MAGE-1与MAGE家族的其它成员有高度同源性，这有助于扩大特异性免疫治疗的范围。在基因佐剂上，本实验选取小鼠的IL-18（mIL-18）。IL-18是Th1型细胞因子，最初被发现能够诱导IFN-γ的产生，因此又称为IFN-γ诱导因子。与IL-12的生物活性相似，IL-18能够增强NK细胞的活性，促进IFN-γ的产生，同时抑制IL-10的产生。研究表明，表达IL-18的质粒能够有效调节由表达HIV-1、FeLV、HSV、以及肿瘤抗原的DNA疫苗所激发的免疫应答。小鼠IL-18与人IL-18前体同源性为65%，存在种属特异性，人的IL-18对小鼠细胞几乎无作用，反之亦然。之所以采用小鼠的IL-18，是为了构建之后的动物实验所用。本课题是采用PCR、酶切、连接等多种分子生物学技术，在原本只含有一个启动子的空质粒pcDNA3中插入目的基因及另一个启动子，构建成含有两套表达系统、能同时表达MAGE-1和mIL-18的共表达重组质粒作为共表达DNA疫苗。通过测序验证，既扩增出与Genbank中一致的mIL-18序列（NM 008360），又发现了一个新的、未见有报道的mIL-18序列，有两个碱基变异，421C→G，导致第141个氨基酸由P→A；444 T→G，导致第148个氨基酸由F→L。目前该序列已被Genbank收录（AY 362457）。双酶切鉴定及测序证实了我们构建的共表达DNA疫苗是正确的。为了验证所构建的重组质粒是否能够有效地表达相应的目的基因，并具有生物活性，本实验将各组质粒分别转染人胚肾细胞（293细胞），对于转染后的细胞，通过RT-PCR和Western blot方法分别鉴定MAGE-1和两种序列的mIL-18在mRNA水平和蛋白质水平的表达，同时以转染了空质粒pcDNA3的细胞为阴性对照。由结果可以看出，所构建的这几组质粒均能够有效地表达相应的目的基因，这为我们下一步继续作体外验证奠定了基础。由于序列号为AY 362457的mIL-18是本实验中首次发现的突变体，是否具有生物学活性需要验证，为此，采用小鼠IFN-γELISA试剂盒检测了转染该重组质粒的细胞的上清对小鼠脾细胞的作用。结果显示，除了空质粒转染组外，随着上清剂量的增加，脾细胞产生的IFN-γ水平不断升高，并且，pcIL-18-1（AY 362457）与pcIL-18-2（NM 008360）之间无显著性差异，表明点突变亦未影响mIL-18的生物活性。重组质粒经体外验证后，又进行了体内验证。分别取单独MAGE-1组、单独mIL-18组、共注射MAGE-1和mIL-18组、以及共表达DNA疫苗pcIL-18-MAGE组的免疫小鼠的<WP=93>脾细胞和血清，通过流式细胞术和MTT分别检测免疫小鼠的T细胞亚群和NK细胞变化情况、血清中MAGE-1多克隆抗体的产生情况、以及免疫小鼠的脾细胞对表达MAGE-1细胞的特异性杀伤作用。结果表明，共表达DNA疫苗注射组小鼠脾T淋巴细胞数量明显增加，CD4/CD8比