结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。近年来，其发病率呈逐渐上升趋势。目前认为，结直肠癌的发生、发展是多基因、多事件累积和多步骤的结果。自从Vogelstein提出经典的结直肠癌发生发展模式以来，已发现多种癌基因和抑癌基因与结直肠癌的发生、发展有关。但是，在这一过程中仍有许多起着重要的作用的已知或未知的基因，讫待我们的发现和研究。 应用抑制性差减杂交法(SSH)，本实验室已经建立了结肠腺癌-正常粘膜(T-N)、结肠腺瘤-正常粘膜(A-N)和结肠腺癌-腺瘤(T-A)三个差减文库，并对这三个文库中的部分基因如IGFBP7、Reg Ⅳ等进行了深入地分析，并得到了有意义的结果。 为了进一步系统地、高通量地分析这些筛选出来的候选差异表达片段并明确这些片段的身份，我们构建了基于Linux的核酸序列自动分析平台。构建分析平台所需的系列软件和非冗余核酸序列数据库来自软件作者以及免费互联网资源，通过自行编写的程序将两者有机结合，使其能够自动地去除载体和重复序列，拼接相关序列以及与核酸数据库进行比对，并将最终比对结果以表格形式输出。我们分别应用该核酸自动分析平台和基于Internet的核酸分析方法(直接将手工去除载体和重复序列的片段递交至公共核酸数据库进行比对)，对T-N文库中的100个克隆进行了独立地分析与综合，并对这两种方法得到的结果进行了比较。经去除载体、重复序列和拼接后，T-N文库得到了15个contigs。将这些contigs与nr00、nr01非冗余核酸数据库进行Blastn比对，结果表明大部分已知基因均已报道与肿瘤发生密切相关，如IGFBP7；还有一些基因在结肠癌的发生发展中从未报道，如eIF4A；部分基因在现有的数据库中未找到同源匹配序列，如contig2、contig11等，提示新基因存在的可能，表明了在结肠肿瘤发生发展中值得进一步探索的空间还很大。两种方法得到的结果基本一致。但基于Linux的核酸自动分析平台的分析方法具有不可比拟的高通量和保密性强等优点，在总体上优于基于Internet的核酸分析方法。浙江大学硕士论文结肠癌差异表达基因的进一步鉴定 由于单个方法本身可能存在着某些缺陷，单个病人的差异状态不能反映整个群体的状态，我们在对SSH得到的差减文库进行生物信息学分析的同时，还对三个差减文库之一T-N文库进行了反向Northem杂交验证。91个克隆杂交信号中，21个上调(腺癌信号/正常组织信号大于2倍)，差异显示率约为23.1%。在差异显示克隆中我们选择了两个基因(THY、eIF4A)，应用半定量RT~PCR法检测其在18例结肠肿瘤中的表达水平，发现两者在结肠腺癌中的表达明显高于相应正常结肠粘膜，差异在统计学上具有显著性意义(TH丫尸一0.018;eIF4A:尸一0.005)。 对以上方法和结果进行分析，我们得出以下结论:!.基于LINUX的核酸自动分析平台能够高通量、高速度地分析差异表达片段，方法简单，结果可信，其构建十分成功。2.THY4、eJF4A在结肠腺癌组织中高表达。3，已验证的差异表达片段以及未知基因的存在证明了肿瘤发生、发展机制的复杂性，表明对肿瘤相关基因进行综合分析的必要性，提示肿瘤发生中分子间相互作用模块(module)的存在。