定向进化是人类模仿自然进化的过程,在实验室中通过分子生物学手段进行蛋白质的改造从而实现生物蛋白快速进化的技术。在蛋白质的定向进化中,核酸分子突变作为第一步起到了至关重要的作用,它决定了改造蛋白的多样性功能。在众多的DNA分子突变技术当中,利用环状的单链DNA(Circular single-stranded DNA,C-ss DNA)来构建蛋白突变体是很有潜力的突变技术。C-ss DNA能够通过与突变寡核苷酸进行高效的退火实现突变点的引入,由于直接在质粒分子上进行操作,所以一般在后期的操作过程中不需要分子克隆步骤。早期的C-ss DNA的制备方法多依赖于利用噬菌体辅助生产,面临着实验过程繁琐、制备工艺复杂等问题。为了更方便和高效地实现蛋白突变体的构建,在本研究中,归巢核酸内切酶I-Hmu I被用于高效制备C-ss DNA,以开发更便捷的核酸突变系统。此外,在针对核酸突变系统的优化过程中,通过采用多循环扩增的方法对异源双链产物进行扩增以改善突变方案实际出现的低突变率问题。结果表明,实验室纯化的切口酶I-Hmu I和核酸外切酶Exo III能够高效制备C-ss DNA。同时,随着对异源双链分子扩增轮数的增加,核酸突变系统的效率得到明显的提升,达到约70%的突变效率。因此,本研究提出了一种可行的突变方案,可以快速实现突变体的构建,为蛋白及核酸分子的相关研究提供了新思路。