论文部分内容阅读
高等植物整个生命周期会经历不同的阶段转型。其中,营养阶段转型(幼年向成年阶段转变)及开花转型(成年向生殖阶段转变)对于植物生存及繁殖至关重要。microRNA156(miR156)及其靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)作为年龄途径的关键组分,在营养阶段转型及开花时间调控过程发挥重要作用。随着植株发育年龄的增加,miR156的表达降低,进而导致靶基因SPL表达升高,促进植物营养阶段转型及开花转型。近年研究显示糖信号能够抑制miR156的表达,然而具体机制仍有待于更深入探究。核因子Y(NUCLEAR FACTOR Y,NF-Y)是一类进化上保守的三聚体转录因子复合物,几乎存在于所有真核生物中。NF-Y异源三聚体主要由NF-YA,NF-YB,NF-YC三个亚基组成。尽管拟南芥NF-YA、YB、YC三个亚基均在开花时间调控过程发挥重要作用,然而NF-YA亚基参与植物开花时间调控的分子机制仍知之甚少。本研究通过对拟南芥NUCLEAR FACTOR Y A8(NF-YA8)转基因植株表型进行探究,发现过表达该基因能延长植物幼年期并抑制开花时间,这与miR156过表达植株的表型相似。我们通过NF-YA8-3MYC转基因植株的转录组数据分析,发现NF-YA8调控众多年龄途径及整合途径开花时间相关基因的表达,表明NF-YA8可能主要通过这两个途径调控植物生长发育进程。以此为出发点,本研究运用生物化学、分子生物学、遗传学等方法,剖析了NF-YA8调控拟南芥营养阶段转型及开花时间的分子机制,主要研究结果如下:(1)我们在拟南芥野生型植株中过表达NF-YA8,并对其进行表型观察及统计分析,发现NF-YA8-3MYC过表达转基因植株(A8-O1、A8-O7和A8-O8)在长日照及短日照条件下均具有明显的晚花表型。此外,NF-YA8-3MYC过表达植株相对于野生型植株具有叶片锯齿状减少及叶片表皮毛推迟的表型。这些结果表明,拟南芥NF-YA8能够抑制营养阶段转型及开花时间。(2)我们通过转录组和RT-qPCR实验探究NF-YA8调控的下游基因,发现NF-YA8能够调控许多年龄途径(SPL3、SPL4、SPL5、SPL5、SPL15)及整合途径开花相关基因(FT、SOC1、FLC和AG)的转录。这些结果表明,NF-YA8可能主要通过整合途径及年龄途径负调控植物开花时间。(3)启动子序列分析显示,在MIR156s及SPLs的转录起始位点(TSS)上游2kb区域含有多个NF-Y转录因子结合的顺式作用元件(CCAAT)。我们利用ChIP-qPCR实验证实NF-YA8能够结合MIR156A、C、D和E启动子CCAAT作用元件,但是不能结合SPLs启动子CCAAT作用元件。随后我们在拟南芥原生质体中利用双荧光素酶报告基因系统进行转录激活实验,结果显示NF-YA8能够直接激活MIR156A、C、D和E的转录,然而当CCAAT位点突变后,这种激活能力明显丧失。此外,我们在烟草叶片中进行转录激活实验,LUC荧光强度及量化结果显示,NF-YA8能够激活MIR156A、C、D和E的转录,这与拟南芥原生质体瞬时转化结果一致。这些结果表明,NF-YA8可能直接结合MIR156s启动子CCAAT作用元件并激活它们的转录,进而调控植物营养阶段转型及开花时间。(4)遗传结果显示,A8-O1转基因植株表现出幼年期延长及开花时间推迟的表型,MIM156(miR156靶标模拟物,可以干扰内源miR156的功能)转基因植株能够加速植物营养阶段转型及开花时间,然而A8-O1MIM156杂交材料具有与MIM156植株类似的幼年期缩短及早花表型,表明NF-YA8在营养阶段转型及开花时间调控过程可能位于miR156的遗传学下游。(5)为了探究NF-YA8-MIR156s转录级联反应的时空调控机制,我们首先通过RT-qPCR及GUS染色实验,证实NF-YA8的表达随叶片年龄的增加而降低,这与miR156的表达模式类似。为了验证NF-YA8蛋白是否在幼年叶片中积累,我们获得NF-YA8p::NF-YA8-LUC转基因植株,通过荧光强度显示NF-YA8-LUC融合蛋白确实在幼年叶片中表达较高,且随着叶片发育年龄的增加而逐渐降低。先前研究表明MIR156A及MIR156C的表达受糖信号调控,我们对拟南芥幼苗进行糖处理实验,证实NF-YA8基因及蛋白表达均受糖抑制。这些结果表明,NF-YA8可能整合了年龄及糖信号,进而调控MIR156s的转录。(6)除了年龄途径,转录组数据显示NF-YA8也能调控整合途径开花相关基因的表达。我们通过RT-qPCR实验证实NF-YA8直接抑制FT的转录。ChIP-qPCR及转录激活实验进一步证实了NF-YA8通过结合FT启动子CCAAT作用元件抑制FT的转录。(7)我们使用酵母双杂交系统筛选到NF-YA8与ELF4蛋白之间能够发生直接相互作用,并通过BiFC和Co-IP等实验技术进一步证实了NF-YA8与ELF4蛋白在植物体内直接互作。(8)遗传结果显示elf4突变体具有明显早花表型,A8-O1过表达转基因植株具有明显晚花表型,然而A8-O1 elf4杂交材料表现出与A8-O1过表达植株类似的晚花表型,表明NF-YA8在植物开花时间调控过程可能位于ELF4的遗传学下游。(9)我们利用双荧光素酶报告基因系统在拟南芥原生质体进行瞬时转化实验,发现单独表达ELF4或NF-YA8蛋白能够抑制FT的转录。当同时表达ELF4和NF-YA8蛋白时,他们对于FT的转录抑制功能明显增强。此外,我们在烟草叶片中进行转录激活实验也得到同样的结果,表明ELF4与NF-YA8可能协同抑制FT的转录进而负调控植物开花时间。综上所述,本研究主要探究拟南芥NF-YA8调控营养阶段转型及开花时间的分子机制。一方面NF-YA8整合了发育年龄及糖信号,并通过直接结合MIR156A、C、D、E启动子CCAAT顺式作用元件,激活它们的转录,进而抑制植物营养阶段转型及开花时间;另一方面NF-YA8能够与ELF4蛋白直接相互作用,进而协同抑制整合途径开花时间相关基因FT的转录,负调控植物开花时间。NF-YA8对于营养阶段转型及开花转型的调控机制确保了植物在合适的发育阶段及合适的季节完成开花转型。