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恐惧是一种与适应能力相关的基本情绪,是面对外界可知或不可知的威胁时激发的学习能力。它可以使生命体产生一系列的防御性机制。适当的恐惧具有预警作用,可以提高人类在陌生环境下的生存适应能力,规避各种潜在的危险。然而,恐惧的功能失常(如恐惧的泛化)则会诱发创伤后应激综合征(post-traumatic stress disorder,PTSD)、单纯恐惧症(simple phobia)、社交恐惧症(social anxiety disorder)、惊恐障碍(panic disorder)等恐惧相关疾病。目前,PTSD的患病率在心理疾病中已排到第四位。超过90%的普通人群在一生中会遭受至少一次严重的创伤事件,而一次严重的创伤事件就有可能诱发PTSD。流行病学研究显示,当普通人群的PTSD患病率约为5-10%时,遭受多次创伤的特定人群患病率更是高达20-30%。PTSD等恐惧相关疾病的特点是罹患速度快,发作周期长,并且在新环境也容易发生泛化。然而,当前临床对恐惧相关疾病的治疗手段依然有限,主要采用基于恐惧消退原理的暴露疗法。它存在着起效慢,疗程痛苦,维持时间短和背景依赖性等诸多缺陷。PTSD等恐惧相关疾病对人类个体和社会带来了沉重的负担。因此,针对恐惧的消退记忆的研究可能为今后的临床治疗创造新的靶点,对恐惧相关疾病的治疗具有重要意义。近年来,神经再生与PTSD之间的关系受到越来越多的关注,尤其是海马齿状回(DG区)的神经再生。海马DG区是认知功能和情绪调控的神经基础。包含DG区的海马三突触通路对于背景关联型恐惧记忆至关重要。最近已有研究显示,海马神经元再生与PTSD关系密切。其证据是促进海马的神经再生可以促进恐惧记忆的模式分离(pattern separation)。因此促进成年神经再生将成为治疗PTSD等恐惧相关疾病的新途径。神经元型一氧化氮合酶(nNOS)广泛地表达于神经元,在部分星形胶质消胞和神经干细胞上也存在。nNOS通过N-端的PDZ(post-synaptic density protein discs-large,ZO-1)结构域与突触后密度蛋白95(post-synaptic density protein 95,PSD-95)结合形成nNOS-PSD-95复合蛋白。PSD-95是一种介导谷氨酸能突触可塑性,调节突触稳定性和树突棘发生的突触蛋白。突触后膜nNOS与PSD-95的耦联调节突触形成,并且参与天门冬酰氨酸(N-methyl-D-asparticacid,NMDA)引起的神经元死亡。nNOS已被证明是神经元再生的一种抑制分子,并在海马中表达。在多种生理和病理条件下,nNOS来源的一氧化氮(NO)不仅抑制神经元再生,同时介导突触丢失引起的认知和运动能力受损。根据我们实验室之前的研究,在大脑中动脉闭塞(MCAO)模型下,降低nNOS-PSD-95耦联水平可以促进新生神经元的增殖和成熟细胞树突棘的形成。因此,nNOS会不会通过影响海马神经元再生调控恐惧的消退?进而成为新的PTSD治疗药物开发的新靶点?我们猜测,阻断海马DG区的nNOS-PSD-95耦联可能对神经再生具有调控作用,而这种作用可能会影响背景关联型远期恐惧的消退记忆。为了证明此推测,本课题设计了三部分内容:(1)研究阻断海马DG区nNOS-PSD-95耦联对神经再生的作用;(2)探讨阻断DG区nNOS-PSD-95耦联对背景关联型远期恐惧的消退记忆的作用；(3)验证海马DG区阻断nNOS-PSD-95耦联后是否对背景关联型远期恐惧消退记忆有影响。第一部分为了研究在背景关联型远期恐惧记忆模型下,阻断nNOS-PSD-95耦联是否促进DG区神经元再生,我们首先对使用的背景关联型远期恐惧记忆模型的可靠性进行了验证,行为学结果显示恐惧记忆在6 w后仍维持很高水平。此后,我们在单侧海马DG区植入注射导管,在恐惧记忆造模24 h后,通过微量给药系统,定位注射特异阻断nNOS-PSD-95耦联的小分子ZL006以及构建重组病毒LV-nNOS-N-N1-133-GFP,阻断DG区nNOS-PSD-95耦联,在第1次给药的7d后进行5-嗅脱氧尿苷(BrdU)标记实验,观察解耦联对神经再生的影响。BrdU标记结果显示,阻断海马DG区nNOS-PSD-95耦联,显著提高新生神经元的增殖数量和存活数量。同时采取同样的实验方案,在给予LV-nNOS-N1-133-GFP病毒4 w后,进行Golgi染色实验,检测解耦联对神经元突触可塑性的影响,结果显示阻断海马DG区nNOS-PSD-95耦联,显著提高了神经元的突触可塑性。因此,第一部分的实验说明,阻断海马DG区nNOS-PSD-95耦联能够促进神经再生以及提高突触可塑性。第二部分为了探究海马DG区阻断nNOS-PSD-95耦联后是否背景关联型远期恐惧消退记忆有影响,我们采用背景关联型远期恐惧记忆模型,在海马DG区给予小分子化合物ZL006、解耦联多肽Tat-nNOS1-133,以及构建重组病毒LV-nNOS-N1-133-GFP特异性阻断nNOS-PSD-95耦联,均显著改善背景关联型远期恐惧消退记忆的提取。为了进一步验证延期给药阻断nNOS-PSD-95耦联对消退记忆的作用,我们在背景关联型远期恐惧记忆造模4 w后,对DG区给予LV-nNOS-N1-133-GFP。行为学结果显示,延期给药阻断nNOS-PSD-95耦联,同样显著改善背景关联型远期恐惧消退记忆的提取。结果说明,阻断海马DG区nNOS-PSD-95耦联显著改善远期恐惧消退记忆的提取,增强了消退记忆,并且这种效应可能是由于阻断nNOS-PSD-95耦联后对神经元再生的促进作用引起的。第三部分为了进一步验证阻断DG区nNOS-PSD-95耦联对神经元再生的促进作用是否是增强背景关联型远期恐惧的消退记忆的神经机制,我们首先在恐惧造模后的nNOS-/-小鼠DG区给予LV-nNOS-N1-133-GFP,行为学结果显示,在nNOS+/+小鼠上阻断nNOS-PSD-95耦联能够改善背景关联型远期恐惧消退记忆的提取,而在nNOS-/-小鼠上消退记忆提取的改善作用消失。以上结果说明,LV-nNOS-N1-133-GFP等解耦联药物对背景关联型远期恐惧的消退记忆的增强作用确实是来源于对DG区nNOS-PSD-95耦联的阻断。然后,为了验证对背景关联型远期恐惧的消退记忆的增强作用是由于神经再生,在背景关联型远期恐惧造模后,我们随机将小鼠分为对照组,治疗组和辐照组,治疗组和辐照组的海马DG区给予LV-nNOS-N1-133-GFP,之后进行Xray辐照实验,清除辐照组的新生神经元,6w后的行为学结果显示,逆转由阻断nNOS-PSD-95耦联引起的神经再生后,对背景关联型远期恐惧的消退记忆提取的改善作用消失。以上实验说明,阻断DG区nNOS-PSD-95解耦联后对神经再生的促进作用改善了背景关联型远期恐惧的消退记忆提取。综上所述,小分子化合物ZL006、解耦联多肽Tat-nNOS1-133,以及构建重组病毒LV-nNOS-N1-1-3-GFP特异性阻断海马DG区nNOS-PSD-95耦联可以促进神经再生以及提高突触可塑性,而此种促进作用可以增强背景关联型远期恐惧的消退记忆。