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创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是神经外科最常见的疾病,是致死和致残的主要原因,尤其是青少年。近年来,随着神经外科治疗方法和治疗药物的不断改进、创新,已显著降低了其死亡率,提高了预后,但治疗后的神经功能恢复情况仍不太令人满意,脑损伤后神经功能障碍发生率较高,多数患者遗留学习记忆能力减弱、肢体功能障碍等问题,这些严重影响了人们的生活质量。如何减少后遗症,提高治疗效果,尤其是认知功能和运动能力的改善,一直是神经科学界努力探索追求的目标。近来,增强脑损伤后的神经保护、减少继发性炎症反应、促进组织修复,愈来愈成为神经医学界关注的焦点。Ephrin配体及Eph受体(产生促红细胞生成素的肝细胞受体,Erythropoietin-Producing Hepatocellular Receptor)统称为Eph受体家族,是新发现的酪氨酸蛋白激酶信号传导系统,Ephrin-B2配体是该系统中的一名重要成员,参与神经细胞间多种作用。在胚胎发育阶段,对神经系统的发育及血管的生成起非常重要的作用;在成年时,它仍然参与细胞间的信号传导,从而影响细胞行为和组织塑形,如诱导细胞迁移和边界形成,特别是在脑损伤后的修复过程中。目的:培育Ephrin-B2基因条件性敲除小鼠,敲除胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性星形胶质细胞内的Ephrin-B2基因;建立TBI动物模型;探讨Ephrin-B2基因在小鼠脑损伤后表达规律及神经损伤修复过程中的作用。方法:1培育Ephrin-B2基因敲除(KO)小鼠:将GFAP-Cre基因型小鼠和Ephrin-B2-LoxP基因型小鼠进行杂交繁殖后代,检测子代小鼠的基因型。2对Ephrin-B2基因敲除小鼠进行健康检测,以C57BL/6野生型(WT)小鼠作为对照,比较神经系统的大体形态,星形胶质细胞形态、数量及分布。3选择雄性、10~12周、重20~30g、健康的Ephrin-B2基因敲除小鼠120只,相同数量的健康、雄性C57BL/6野生型小鼠作为对照,建立可控性皮层损伤模型。4将两种TBI小鼠,按四个时间点:3天、7天、14天和21天各分为4组,将无损伤的小鼠作为空白对照。于各时间点采集标本,进行以下检测:免疫荧光组织化学染色检测脑损伤后Ephrin-B2蛋白和GFAP的表达、分布情况;Western blotting检测损伤周围Ephrin-B2蛋白、磷酸化的Ephrin-B2(pEphrin-B2)蛋白和GFAP的表达改变;Q-PCR检测损伤周围及损伤同侧海马区域GFAP mRNA表达的动态变化;Nissl染色检测损伤后21天时的损伤体积;采用平衡木行走试验(Beam Walking Test)和转圈试验(Rotarod Test)进行神经功能行为学评分。5星形胶质细胞培养和划痕损伤试验:将两种小鼠脑皮层星形胶质细胞培养,免疫荧光组织化学染色检测星形胶质细胞Ephrin-B2蛋白和GFAP的表达情况,并检测划痕损伤后两种星形胶质细胞长入损伤区域的细胞数目,检测在修复过程中的不同表现。结果:1 Ephrin-B2基因敲除小鼠表现形与C57BL/6野生型小鼠相似,无明显差别:全脑的大小,重量以及形态相同,显微镜下检测星形胶质细胞形态,大小和分布亦与野生型小鼠无差别,Western Blotting检测显示KO小鼠脑皮层GFAP表达略高于WT小鼠。2免疫组织学染色显示Ephrin-B2蛋白在WT小鼠脑损伤后21天内在损伤周围表达逐渐增加,Ephrin-B2蛋白主要表达于GFAP阳性的星形胶质细胞膜和突起上;KO小鼠脑损伤后损伤周围无Ephrin-B2蛋白表达。3 Western blotting结果显示WT小鼠脑损伤后Ephrin-B2,pEphrin-B2和GFAP的表达在损伤周围明显增加。尽管Ephrin-B2蛋白表达在脑损伤后第3天时稍下降,但是在3天以后逐渐升高,在21天时最高。pEphrin-B2和GFAP的表达曲线表现为相同的改变趋势,在第7天时表达量最高。4 Western blotting结果还显示KO小鼠在脑损伤后GFAP的表达明显高于WT小鼠。WT小鼠GFAP的表达在第7天时最高,而KO小鼠GFAP的表达在21天内持续升高,在第3天时KO小鼠GFAP的表达是WT小鼠的4.7倍,在第7天时是WT小鼠表达量的2.8倍,在第14和21天KO小鼠GFAP的表达仍明显高于WT小鼠。Q-PCR方法检测KO小鼠GFAP mRNA的表达均较WT小鼠呈明显增加(p<0.05) ,无论是在损伤周围还是在同侧海马区域,这与GFAP的表达趋势相同。5 Nissl染色示Ephrin-B2基因敲除小鼠在脑损伤后21天时形成的损伤空洞体积较小。6细胞培养结果显示Ephrin-B2基因敲除后的星形胶质细胞在损伤后更易于分裂增殖,更快向损伤区域聚集。7行为学评分示Ephrin-B2基因敲除小鼠在脑损伤后神经功能恢复较好。结论:WT小鼠脑损伤后,Ephrin-B2配体在损伤周围的星形胶质细胞膜上表达明显上调,信号传导增加;Ephrin-B2基因敲除小鼠脑损伤后,Ephrin-B2配体不再表达,致使星形胶质细胞活化迅速且明显增多,在损伤后3天时,GFAP mRNA的表达就已明显增高,GFAP合成增加,反应性的星形胶质细胞增加了神经保护作用,减轻了继发性组织损伤,从而促进了损伤修复和神经功能的恢复,减少了后遗症的发生。因此,如何定时定量地调节Ephrin-B2的信号传导,从而调控星形胶质细胞的活性,减少继发性组织损伤,扩大损伤后星形胶质细胞的保护作用,有望成为治疗颅脑损伤的重要手段。