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目的:结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在许多组织器官纤维化时表达明显增高,它不仅可直接介导原代肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化、增殖及迁移,还能促进活化HSC合成及分泌细胞外基质(extracel lular matrix,ECM)。金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)是近年发现的一种由巨噬细胞和结缔组织细胞产生,可抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)活性的糖蛋白,而MMPs可促进胶原纤维降解,是纤维化的抑制因子。所以,减少CTGF和TIMP-1的表达,可以从不同途径,减轻纤维化程度。本研究旨在筛选CTGF和TIMP-1的RNA干扰靶位,有效的抑制纤维化。
方法:在GenBank中查询大鼠CTGF和TIMP-1基因序列,在线设计各3个RNA干扰候选靶位,化学合成双链RNA(dsRNA),分别命名为CTGF-1、CTGF-2、CTGF-3、TIMP-1-1、TIMP-1-2、TIMP-1-3,各自转染或不同组合转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞,并设立阴性对照组(no-sense)和空白对照组。每组3复孔,测值取均数。48h后抽提RNA并逆转录成cDNA通过荧光定量PCR测定CTGF和TIMP-1、procol-α 1mRNACt值,用比较阈值法计算出procol-α 1、CTGF和TIMP-1mRNA的相对表达量,计算抑制率。并取转染48h后的HSC上清液用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)检测肝纤维化指标进行比较分析。
结果:荧光定量PCR结果显示:CTGF-1组、CTGF-2组、CTGF-3组间相互比较,对CTGFmRNA表达均有不同程度的抑制作用,以第三段为靶的“CTGF-3”最佳(CTGFmRNA被抑制率达68.0996)。CTGF三个不同靶位RNA干扰与TIMP-1三个不同靶位干扰联合作用后,对CTGFmRNA的抑制有不同程度增加,其中以二者的第三靶位联合干扰对CTGFmRNA的抑制作用增加最多(CTGFmRNA被抑制率达76.60%,较单独的CTGF第三靶位增加8个百分点)。TIMP-1-1组、TIMP-1-2组、TIMP-1-3组间相互比较,对TIMP-1 mRNA表达均有不同程度的抑制作用,也以第三段为靶的“TIMP-1-3”最佳(TIMP-1mRNA被抑制率达68.55%)。CTGF三个不同靶位RNA干扰与TIMP-1三个不同靶位干扰联合作用后,对TIMP-1mRNA的抑制有不同程度增加,其中以二者的第三靶位联合干扰对TIMP-1mRNA的抑制作用增加最多(TIMP-1mRNA被抑制率达78.05%,较单独的TIMP-1第三靶位增加9个百分点)。单独的CTGF或TIMP-1所有单个靶位的RNA干扰,均能减少其下游产物Procol-α 1mRNA的转录,其中,二者的第三靶位单独作用时效果最好,抑制率分别可达到65.03%和62.84%;然而,当以这两个基因不同的靶位组合联合进行RNA干扰时对Procol-α 1mRNA的转录的抑制作用最强者,是CTGF第二靶位与TIMP-1第三靶位组合,抑制率达85.79%。肝纤维化指标检测结果显示:单一的CTGF和TIMP-1所有靶位的RNA干扰抑制Ⅲ型胶原、HA、LN表达的比较,分别以第三段为靶的CTGF和第三段为靶的TIMP-1抑制作用最强。CTGF三个不同靶位RNA干扰与TIMP-1三个不同靶位干扰联合作用后,对Ⅲ型胶原、HA、LN的抑制均有不同程度增加,以CTGF第二靶位与TIMP-1第三靶位联合干扰对Ⅲ型胶原、HA、LN的抑制作用最强。
结论:成功筛选出CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位,其两者联合干扰也能高效抑制其表达,且联合干扰较单独干扰效果更强,这为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了实验基础。