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本研究包括三个部分。 1.伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立 伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由a疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种严重传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者。该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。 本研究根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PrV)各基因的序列,设计了与PrV的gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PrVDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用这3对引物对TK~-/gI~-/gE~-三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重PCR可以检测到106pg三基因缺失疫苗毒或756pg PrV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。 2.基因芯片技术检测PrV的研究 选取了猪伪狂犬病病毒(PrV)gD,gB,gE基因(gE~-,gE)、蓝耳病病毒(PRRSV)ORF6、圆环病毒Ⅱ(PCV2)ORF2、细小病毒(PPV)NS1、乙型脑炎病毒(JEV)NS1的保守片段(200-300bp)和作为内参的猪源看家基因GAPDH部分片段(250bp)、人β-actin等片段作为捕获探针并设计了特异性引物,固定在芯片上,制成芯片;编码PrV野毒株和gE~-突变株保守性糖蛋白的gD,gB,gE基因,通过多重PCR扩增,产物经过纯化、标记、变性后杂交到制备的芯片上,结果表明PrV野毒株和gE~-突变株gD,gB均出现阳性杂交信号,然而,在gE基因缺失的部位(gE~-),PrV野毒株出现阳性杂交信号,gE~-突变株不出现杂交信号。PrV PCR产物和PRRSV,JEV,PCV2,PPV的捕获探针间无非特异性杂交信号。芯片能够最低检测出3.24fg的DNA模板,其敏感性至少比普通gD-PCR高10倍。本研究说明基因芯片技术能检测伪狂犬病病毒并鉴别野毒与gE~-突变株感染。 3.胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖基因的克隆表达 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae, App)引起的一种具有高度传染性的呼吸道疾病,是危害当前世界各国养猪业的主要传染病之一,给养猪业造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖是该菌的毒力相关因子,且荚膜多糖的血清型差异及合成的数量决定了菌毒力大小。本实验参考猪胸膜肺炎放线杆菌血清型2型荚膜多糖的基因序列(Genbank AY 357726)分别设计了三对特异性引物,通过PCR扩增,获得了长度分别为1137bp、