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B类清道夫受体(the class B scavenger receptor,SR-B)是一种位于细胞表面的跨膜糖蛋白,主要包括SR-BⅠ、SR-BⅡ和CD36。SRB可与多种配基结合,其在细胞和组织中分布也较为广泛,参与很多生理和病理过程,如机体免疫防御、凋亡细胞清除、动脉粥样硬化及其它心血管疾病等。目前在很多物种中SR-B基因的序列、结构、表达和功能已经得到了比较深入的研究。而在文昌鱼中的研究却一直未见报道。文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文克隆了青岛文昌鱼(Branchiostomajaponicum)的具有完整开放阅读框的SR-B同源基因(BjCD36),并对其进化、表达和功能进行了研究。主要研究结果如下:
第一,我们对青岛文昌鱼中的SR-B基因进行了鉴定。在弗罗里达文昌鱼中我们发现了五个SR-B的同源基因(SRB-a,b,c,d,e)它们编码的氨基酸序列长度分别是480aa、445 aa、912aa、229 aa、159 aa,但是通过NCBI上保守的结构域分析发现只有三个基因(SRB-a,b,c)编码的蛋白质有完整的CD36结构域。最后通过多序列比对发现,SRB-a与SR-B的相似度与其他四个相比更高,并且SRB-a与CD36的相似度比它与SR-BⅠ/Ⅱ的相似度要高,另外,通过基因结构分析发现,SRB-a基因的基因结构与脊椎动物尤其是斑马鱼的极为相似。所以我们首先将SRB-a基因确定为我们在青岛文昌鱼中的研究对象。此外,我们对脊椎动物CD36基因的基因结构、内含子类型和在染色体上的位置等进行了分析,结果显示CD36基因在脊椎动物中高度保守,暗示CD36基因的功能在进化过程中可能具有保守性。
第二,我们在青岛文昌鱼中通过RACE-PCR技术克隆了SRB-a(本文命名为BjCD36)并对其序列进行了分析。BjCD36全长1711 bp,开放阅读框(ORF)含有1482 bp,编码494个氨基酸的蛋白质。并且通过多序列比对发现该序列与弗罗里达文昌鱼中SRB-a基因的氨基酸序列之间的相似性高达90%。
第三,我们对BjCD36基因在文昌鱼中的组织和胚胎发育中的时空表达情况做了研究。Real-time PCR和切片原位杂交结果显示,BjCD36在成体组织的肝盲囊中表达量最高,在其他组织中的表达相对要低。胚胎原位杂交显示,BjCD36在早期胚胎及一天幼虫中都有表达,在两天幼虫中是在幼虫的前三分之一处表达,表明该基因可能在胚胎发育中发挥重要作用。
第四,为了研究BjCD36基因是否有免疫相关功能,我们用大肠杆菌处理文昌鱼,发现大肠杆菌感染后BjCD36的表达上调。此外,我们用不同浓度的LTA处理转染了BjCD36的牙蚜鲆鳃细胞系(FG),结果发现10μg/ml或20μg/ml的LTA都能诱导BjCD36上调表达。体内和体外实验都证明了BjCD36是与免疫相关的基因,参与到机体免疫过程。为了研究BjCD36是否是与摄食调控相关,我们对文昌鱼先喂食,接着进行饥饿处理,发现在喂食后2 h鳃中BiCD36的表达显著升高,随后随着饥饿时间的延长,BjCD36的表达逐渐降低,表明BjCD36基因确实是参与到了文昌鱼的摄食调控过程中。由此,我们证明BjCD36参与免疫与摄食调控,与高等脊椎动物CD36基因具有功能上的保守性。