本文在大肠杆菌中重组表达三种肝素酶,在摇瓶中通过表达条件优化提高目标蛋白的可溶表达量,进一步于5L发酵罐中扩大培养,在此基础上利用Ni离子亲和层析纯化蛋白,最后对蛋白的活性进行了测定。首先,优化肝素酶Ⅰ在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/pOFX-T7-SL1中的重组表达条件,结果显示在MBL培养基中,接种6h(OD600≈2.5)后加入0.25mM IPTG,在25℃下表达8h目标蛋白酶活达到最高值1.49×105IU/L。进一步于5L发酵罐中扩大培养,20h后最高酶活达到5.55×105IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素酶Ⅰ的纯度可达到96%,回收率为37.58%,比酶活达到1.12×103IU/mg。其次,优化肝素酶Ⅱ在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中的重组表达条件,结果显示在MBL培养基中,在对数生长期初期(OD600≈2.5)后加入0.5mMIPTG,在25℃下表达6h目标蛋白酶活达到最高值8.70×103IU/L。进一步于5L发酵罐中扩大培养,18h后最高酶活达到2.35×104IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素酶Ⅱ的纯度可达到90%,回收率为47%,比酶活达到196IU/mg。最后,优化肝素酶Ⅲ在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的重组表达条件,结果显示在MBL培养基中,在对数生长期初期(OD600≈2.5)后加入0.1mMIPTG,在20℃下表达6h目标蛋白酶活达到最高值4.02×103IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素酶Ⅲ的纯度可达到87%,回收率为42%,比酶活达到9.33IU/mg。本研究工作为低分子肝素的大规模酶法制备以及肝素类多糖物质的结构分析,奠定了坚实的物质基础。