鸡肉中食源性致病菌的表面增强拉曼光谱检测方法研究

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食源性致病菌是当前造成食品安全隐患的公共危害之一,对食品产业的发展和消费者的身体健康以至于生命安全都构成严重威胁。除猪肉外,鸡肉是我国的第二大肉类消费品,具有营养价值高、接受人群广等优点。但是由于鸡肉的水分含量高,比其他肉更容易感染微生物。因此,快速检测鸡肉中的致病菌对保证鸡肉品质以及维护消费者身体健康非常重要。表面增强拉曼散射(SERS)光谱作为一种简单、快速、灵敏的检测技术,已经广泛应用到了材料化学、食品检测、环境分析和生物医药等领域。因此,本研究尝试使用SERS技术并结合化学计量学构建定性识别模型和定量检测体系以快速、准确地检测鸡肉中的食源性致病菌。具体研究内容如下:1.食源性致病菌的SERS检测原理研究。以四种假单胞菌为检测对象,研究了金纳米棒增强的细菌SERS光谱的影响因素、物质基础、分类趋势。首先制备了一种表面带正电荷的金纳米棒(Au NRs)SERS基底,其能与表面呈负电位的四种假单胞菌发生静电吸附结合从而增强四种菌的拉曼信号;然后采集了四种假单胞菌的SERS光谱并分析了影响细菌SERS光谱的主要因素和造成细菌SERS光谱特征峰的物质基础,发现细菌本身、细菌与Au NRs的吸附程度和吸附均匀性是影响细菌SERS光谱的主要因素,而细菌表面的蛋白质、氨基酸、核酸和脂质等成分是造成细菌SERS光谱特征峰的物质基础。最后利用主成分分析(PCA)和线性判别分析(LDA)对四种假单胞菌的SERS光谱进行了分类,并通过LDA筛选出了造成细菌SERS光谱差异的主要变量,发现细菌表面的酰胺、C-C变形和C-H拉伸的类型和数量造成了分类趋势。2.鸡肉中食源性致病菌的SERS免标记定性检测研究。以三种革兰氏阳性致病菌(金黄色葡萄球菌(ATCC 29213和BNCC 186335)和单增李斯特菌(ATCC 1915))为检测菌种,建立一种能定性检测鸡肉中三种革兰氏阳性致病菌的识别模型。首先合成了一种修饰了万古霉素的磁性捕捉探针(Fe3O4@Au-Van),并验证了Fe3O4@Au-Van对三种革兰氏阳性致病菌的捕捉效果;然后采集了捕捉后102104 CFU/mL的上述三种致病菌的SERS光谱,并以LDA的分类准确率为依据筛选出了标准正态变量变换(SNV)预处理以消除光谱噪声;接着利用SNV预处理后的光谱数据建立了软独立模式分类法(SIMCA)、K最近邻法(KNN)和偏最小二乘判别分析法(PLSDA)三种定性识别模型,其中PLSDA模型的识别准确率最理想(训练集为99.1%,预测集为90.3%);最后利用最优的PLSDA模型识别实际鸡肉样品中的细菌种类,结果显示该模型对鸡肉样品中的两种金黄色葡萄球菌(BNCC 186335和ATCC 29213)和单增李斯特菌的识别准确率分别为80%、90%和90%。3.鸡肉中食源性致病菌的SERS定量检测研究。以金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)为检测菌种,构建了一种能特异性定量检测鸡肉中金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的体系。首先通过一步反应法合成了Fe-MIL-88纳米酶和磁性捕捉探针并对其分别进行了表征;然后优化了捕捉探针富集金黄色葡萄球菌的用量、Fe-MIL-88纳米酶催化隐色孔雀石绿(LMG)的用量以及金黄色葡萄球菌适配体抑制Fe-MIL-88纳米酶的用量,构建了一种使催化产物孔雀石绿(MG)与金黄色葡萄球菌含量呈正相关的反应体系;接着采集了在不同金黄色葡萄球菌浓度下反应结束后体系的SERS信号,并将SNV预处理后的SERS信号与金黄色葡萄球菌浓度的对数值建立标准曲线,其线性关系为y=0.089x-0.155,R2=0.987,最低检测限(LOD)为2 CFU/mL;最后,将该检测体系与平板计数法同时用于鸡肉样本中金黄色葡萄球菌的检测,并通过T检验证实了两种方法的检测结果无显著性差异。本研究旨在减少鸡肉中食源性致病菌的检测时间、检测步骤和检测成本,为鸡肉及其他肉制品中食源性致病菌的快速、准确检测提供了新方法和新思路。研究结果为鸡肉中食源性致病菌的快速定性定量检测提供了新选择,对保证鸡肉的食用安全、维护消费者的身体健康和促进鸡肉产业发展都有非常重要的作用。
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