背景与目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症是一种红细胞酶的缺陷病。它被发现在半世纪以前,是最常见的性连锁遗传疾病之一,据统计全球约四亿人患有此病,本症常在疟疾高发区、地中海贫血和异常血红蛋白病等流行地区出现。我国华南及西南各省、自治区(广东、广西、云南及四川)等地为高发区,据报道广东省G6PD缺乏症的发生率在6%左右。患者常在急性感染、进食蚕豆或接触氧化性药物等诱因下发病。发病时临床表现为急性溶血性贫血和由此而产生的高胆红素血症,是引起新生儿高胆红素血症,甚至不可逆性胆红素脑病或核黄疸的重要原因之一黄连是常用中药,其药用始载于《神农本草经》,味苦,性寒,有泻火、解毒、清热、燥湿的功能。现代研究表明黄连主要含生物碱,以小檗碱(即黄连素Berberine)为主要成分。黄连具有多方面的药理作用,包括抗菌、抗病毒、抗原虫、抗真菌、抗腹泻、抗脑缺血、抗炎、免疫调节作用、甚至有抗溃疡、抗癌等功效。中医自古有给新生儿服用黄连的黄连法,清朝皇室有给新生儿服用含黄连的福寿丹开口的传统。至今,安徽、湖南、江西、四川、福建、广东、广西、台湾等南方诸省民间仍有给新生儿服用黄连方剂的习惯。新加坡黄学文教授在研究新生儿核黄疸病的过程中发现,华族新生儿黄疸发病率明显高于白种人,同时,发现这些新生儿或他们的母亲在围产期曾有服用黄连等中药的病史,联想到二次世界大战期间美军黑人为防治疟疾服用伯氨喹啉等药而引起急性溶血的病理过程,由此认为黄连等中药可能属于氧化剂药物,有诱发6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)缺陷的新生儿发生溶血性黄疸的可能。为此,新加坡卫生部于1978年10月6日宣布：新加坡全国禁止使用和买卖黄连及含小檗碱的药物。同时新加坡药物咨询委员会要求,采用西医方法进行科学实验并提呈有科学根据的研究报告。此后,关于黄连等中药是否会引起G6PD酶缺陷患者发生溶血这一课题进行了不少研究,但结果不一。我国学者林娜研究发现治疗剂量的黄连对正常大鼠离体血红细胞渗透脆性没有明显影响；黄连和小檗碱对实验性G6PD缺陷大鼠红细胞渗透脆性也没有明显影响给妊娠小鼠服用黄连和小檗碱,其胎仔血清总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、血红蛋白定量,较对照组都没有发现有统计学差异,推测其不能引起溶血。香港大学儿科专家杨则认为,川黄连、牛黄、腊梅花、茵栀黄等中药有加重新生儿黄疸的危险性。王磊等研究认为黄连能使G6PD酶缺乏合并痢疾感染(G6PD-BD)大鼠红细胞渗透脆性增加。廖华薇通过回顾性临床分析研究报道孕产妇服用黄连可能有增加G6PD酶缺乏的新生儿发生急性溶血的可能性。而台湾学者廖昌立等认为黄连不仅不会诱发溶血和发生新生儿高胆红素血症,相反具有一定的退黄作用,与记载的黄连利胆作用相符。Fok认为,黄连等中药与正常和G6PD缺陷新生儿黄疸的发生无关,也不能治疗和预防新生儿黄疸。目前对黄连是否会诱发G6PD缺陷患者发生溶血的研究结果不一,可能与研究对象及研究方法不一有关,也可能与中药制剂、剂量不同有关。例如：1、新生儿期临床研究影响因素较多,可合并ABO溶血、感染、缺氧等；新生儿出生后有一个生理性溶血过程,红细胞本身稳定性差；另有报道称新生儿期红细胞G6PD酶稳定性差,新生儿时期可能有一过性G6PD酶低下,至生后3个月可恢复正常。故采用新生儿红细胞作为研究对象,影响因素较多。2、既往研究对象多以正常新生儿为主,缺乏对照组,G6PD缺乏患儿例数很少,缺乏统计学意义。3、实验研究采用对红细胞内G6PD活性有干扰作用的强氧化剂乙酰苯肼药物(APH)为造模药,复制G6PD缺陷大鼠模型,但药物造模与实际病人红细胞有一定差距,且选择研究指标为离体红细胞渗透脆性,该指标敏感不够。黄连为中药材,产地不同、季节不同及提炼过程不同均可能影响其药物有效成分含量,而盐酸小檗碱(即黄连素)(Berberine, Ber)是黄连中发挥其核心药理作用的主要成分,含量可达10%左右,其各项药理指标稳定、成熟,便于控制,传统认为小檗碱口服吸收差,并有报道证实这一点。李宝馨等研究发现家兔口服小檗碱50mg.kg-1,血浆峰浓度为92.7ug.L-1；宝丽华等研究发现健康人口服300mg小檗碱后血浆峰浓度达0.39mg.L-1；上世纪五十年代有人用荧光法进行测定,发现人口服盐酸小檗碱0.4g,30min后,血中浓度为1 mg/L以下,但每隔4h连续服药5次,血药浓度不见升高。临床上盐酸小檗碱用量为0.1-0.3g,一日3次,因此按正常量口服盐酸小檗碱后,其血浆峰浓度多小于1 mg/L。本实验拟采用成人G6PD酶缺陷患者无病状态下静脉全血红细胞为研究对象,采用盐酸小檗碱作为实验药物,选择四个药物浓度,分别为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L和5.0mg/L,覆盖小剂量至超大剂量。观察不同浓度盐酸小檗碱对G6PD酶缺陷患者红细胞形态、红细胞计数、血浆游离血红蛋白、G6PD酶活性的影响,探讨盐酸小檗碱诱发G6PD酶缺陷患者红细胞发生溶血的可能性,以及药物浓度与溶血的关系,试图为黄连能否应用于G6PD酶活性缺陷患者提供实验依据。研究方法1.主要试剂和材料：本实验所用盐酸小檗碱(Berberine, Ber)标准品制剂购买于广州市药品检验所,批号110713-200911、盐酸小檗碱用生理盐水配成25mg/L、5mg/L、2.5mg/L、0.5mg/L的浓度,测定各浓度盐酸小檗碱溶液PH值与渗透压低温保存备用；G6PD酶活性定量检测试剂盒购于广州市科方医疗器械有限公司；邻-甲联苯胺法试剂购于汕头市光华化学厂；全血细胞分析仪型号：GY2-3000。2.研究对象：南方医院门诊查体中心,送检G6PD酶活性测定的健康成人,年龄18-55岁,试剂盒正常参考值1.3～3.6KU/L,本研究设定G6PD酶活性低于1.2KU/L以下者纳为实验对象。G6PD下降者20例,G6PD酶活性范围0.01-1.OKU/L(平均0.39±0.32KU/L),G6PD酶活性正常者20例,G6PD酶活性范围1.93-3.15KU/L(平均2.93±0.30KU/L),取静脉全血6ml,采用ACD抗凝。3.试验分组：按血中盐酸小檗碱的浓度不同分为4组,分别为：Ber 0.1mg/L组、0.5mg/L组、1.0mg/L组、5.0mg/L组,以及药物空白对照组(生理盐水组)和阳性对照组(蒸馏水组)。将样本分为六等份,每份800ul,分别加入生理盐水配制的不同浓度的Ber 200u1.生理盐水和蒸馏水各200ul,加药30分钟后检测各项指标。4.不同浓度Ber对红细胞形态的影响：取待检全血一滴,置于载玻片上,推片。采用瑞士染色,并于10*40倍显微镜下观察红细胞形态,照相机采图。5.不同浓度Ber对红细胞计数的影响：使用全血细胞分析仪,将待测样本置于全血细胞分析仪吸液管下,按吸液按钮,仪器自动生成结果。工作基本原理是利用两端电极之间的压力产生电脉冲,脉冲幅度的大小区分不同的细胞,而同幅度电脉冲进行计数就可得到颗粒的数量。6.不同浓度Ber对游离血红蛋白的影响：游离血红蛋白(Free Hemoglobin,FHb)是指血浆中血红蛋白的量。通常血红蛋白存在于红细胞中,当红细胞破坏,血红蛋白释放,即溶血发生时,血浆游离血红蛋白增加。取离心后上层血浆为待检血浆,采用邻-甲联苯胺法测定血浆游离血红蛋白值,取3支试管,分别标明空白管、标准管、试验管,按步骤加入实验试剂,于435 nm比色,以空白管调零(相应浓度的盐酸小檗碱溶液),读取各溶液吸光度记为A值。游离血红蛋白(mg/L)=(At/As)*100(At为测定管A值,As为标准管A值)。6.1.不同浓度Ber分别对血浆和全血中血浆游离血红蛋白的影响：预试验结果发现,全血中加入Ber后,血浆游离血红蛋白水平不仅不升高,反而低于生理盐水组,提示Ber可能有降低血浆游离血红蛋白的作用,影响对溶血的判断。试想如果全血中没有红细胞的破坏,血浆中游离血红蛋白的量与全血中游离血红蛋白的量相同,全血和血浆中分别加入盐酸小檗碱后,血浆游离血红蛋白依然相同,因此作者将静脉全血样本分成10份,前5份直接加入不同浓度盐酸小檗碱,另5份离心后取上层血浆,再在血浆中加入不同浓度盐酸小檗碱,比较全血与血浆两者血浆游离血红蛋白水平的差异,检测方法同前。6.2.加入Ber后血浆游离血红蛋白水平的动态变化：预试验结果发现,加入盐酸小檗碱后血浆游离血红蛋白下降,为了解这种现象是短效或长效的影响,因此作者选Ber血中最终药物浓度为5mg/L为加药浓度,分别于加药后10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时检测血浆游离血红蛋白值,同时,不同时间点设空白药物组做对照组,检测方法同前。6.3.加药6小时后不同浓度盐酸小檗碱对血浆游离血红蛋白的影响：预试验结果发现,Ber对血浆游离血红蛋白测定影响在加药6小时后消除,此时检测有利了解血浆游离血红蛋白值的原本状况,故加药后30分钟离心分离血浆,将血浆置于4℃冰箱保存,6小时后检测血浆中游离血红蛋白值,检测方法同前。7.不同浓度Ber对G6PD酶活性的影响：G6PD酶活性定量检测试剂中含葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)、待测样品中G6PD酶催化G6P生成6-磷酸葡萄糖酸酯(6-phosphogluconate,6PG)同时将氧化型辅酶Ⅱ(NADP)变成还原型辅酶Ⅱ(NADPH),检测340nm吸光度上升的速度,可以计算出样品中G6PD的活性。用加样器精确吸取20ul压积红细胞加入1ml溶解液中,红细胞完全溶解后,取20ul溶解液加入500ul试剂中,混匀后HCC-9906半自动生化仪上测定。8.统计方法各组数据应用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据采用平均数±标准差表示X±S表示,两配对设计计量资料均数比较确定差值服从正态分布时,采用配对样本t检验,差值不服从正态分布,采用Wilcoxon one-sample test。两处理组重复测量数据采用重复测量因素的方差分析(拒绝球形检验时,采用Greenhouse-Geisser法),P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.不同浓度盐酸小檗碱对红细胞形态的影响G6PD酶活性正常组：与生理盐水组相比,加入不同浓度盐水小檗碱后,红细胞形态无改变,而蒸馏水组红细胞双凹圆盘状结构减少,红细胞肿胀、皱缩、变形红细胞及红细胞碎片增加；G6PD酶活性缺陷组：与生理盐水组相比,0.1mg/L、0.5mg/L浓度组红细胞形态无明显改变,随浓度增加上述红细胞形态改变更显著,蒸馏水组较G6PD酶活性正常组红细胞破坏现象更明显。2.不同浓度盐酸小檗碱对红细胞计数的影响G6PD酶活性正常组：与生理盐水组相比,各浓度盐酸小檗碱对红细胞计数影响无统计学意义(P值>0.05),蒸馏水组红细胞计数明显减少,差别有统计学意义(P值<0.05)；G6PD酶活性缺陷组：与生理盐水组相比,0.1mg/L及0.5mg/L组红细胞计数的改变无统计学意义(P>0.05),而1.0mg/L与5.0mg/L组红细胞计数下降,其改变有统计学意义(P<0.05),蒸馏水组红细胞计数明显减少,差别有统计学意义(P值<0.05)。3.不同浓度盐酸小檗碱对全血中血浆游离血红蛋白水平的影响全血中加入盐酸小檗碱溶液后,与生理盐水组相比,发现无论G6PD酶活性正常组或G6PD酶活性下降组血浆游离血红蛋白水平均下降(P<0.05),且随着药物浓度的增大,血浆游离血红蛋白水平呈进一步下降趋势,而蒸馏水组血浆游离血红蛋白均升高,且与生理盐水组相比差异有统计学意义(P<0.05)。4.全血和血浆中分别加入盐酸小檗碱溶液后血浆游离血红蛋白值比较：G6PD酶活性正常组全血和血浆中加药后相比,血浆游离血红蛋白值差异无统计学意义(P>0.05),但G6PD酶活性缺乏组全血中加Ber后血浆游离血红蛋白值高于血浆中加Ber组,且1.0mg/L及5.0mg/L组其差异有统计学意义(P<0.05)。说明全血中游离血红蛋白含量增加,提示有红细胞破坏现象。5.血浆中加入Ber后血浆游离血红蛋白水平的动态变化：为了解Ber能使血浆游离血红蛋白测定值降低的时效性,观察在加药后不同时间点血红蛋白值变化。结果发现加药后不久血浆游离血红蛋白值既开始下降,至加药后60分钟降至最低点,后逐渐回升,至加药后6小时几乎回升至加药前水平,之后未见明显变化,提示盐酸小檗碱使血浆中游离血红蛋白测定值下降的时效在6小时以内。6.加药6小时后不同浓度盐酸小檗碱对血浆游离血红蛋白的影响：为了排除Ber能在6小时内使血浆游离血红蛋白测定值降低的影响,于加药后6小时检测血浆游离血红蛋白值。结果显示：与生理盐水相比,G6PD酶活性正常组随盐酸小檗碱浓度增大,血浆游离血红蛋白值无明显变化(P>0.05)；G6PD酶活性缺乏组随盐酸小檗碱浓度增大,血浆游离血红蛋白值呈增高趋势,且与生理盐水组相比,1.0mg/L组,5.0mg/L浓度组差异有统计学意义(P<0.05),其他组差异均无统计学意义(P>0.05)。7.不同浓度盐酸小檗碱对G6PD酶活性测定值的影响：G6PD酶活性正常组：与生理盐水组相比,随盐酸小檗碱浓度增大,G6PD酶活性无明显变化,蒸馏水组G6PD酶活性明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)；G6PD酶活性缺乏组：随盐酸小檗碱浓度增大,G6PD酶活性呈增高趋势,与生理盐水组相比,1.0mg/L,5.0mg/L浓度组差异有统计学意义(P<0.05),而蒸馏水组酶活性增高,与生理盐水组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。总结：以G6PD酶缺陷患者红细胞为研究对象,观察中药黄连的主要药理成分---盐酸小檗碱,在4个药物浓度对患者红细胞的影响,结论如下：1.血药浓度小于等于0.5mg/L时,对G6PD酶缺乏者红细胞无明显影响;血药浓度为lmg/L及5mg/L时对G6PD酶缺乏者红细胞可能有影响,提示患者服用较大剂量的黄连时要警惕有诱发溶血的可能性。2.发现4个浓度的盐酸小檗碱均可导致血浆游离血红蛋白测定值降低,其浓度越高下降越明显；盐酸小檗碱对血浆游离血红蛋白影响的时效性在6小时之内,药效的峰值在加药后1小时,该现象原因不明,其机制以及是否与民间的退黄作用有关值得进一步的探讨。