蔗渣酸化甘油预处理液中活性物质的分离与保湿活性研究

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酸化甘油预处理蔗渣能够破坏蔗渣结构的化学键,脱除蔗渣中的木质素和半纤维素,是提高蔗渣纤维素利用率和酶解效率的重要方法,在蔗渣的制浆造纸和生物乙醇生产工艺中得到广泛应用。蔗渣酸化甘油预处理液作为该过程的副产物,并未得到充分的研究。在预处理液中可能存在木质素、酚类、糖类和甘油衍生物等活性物质,对其进一步的开发及高值化利用尤为重要。首先,用四氢呋喃(THF)萃取预处理液得四氢呋喃相,再进一步分离纯化得到水溶性木质素(WL)和水不溶木质素(NWL),并对所得WL和NWL的理化特性及其抗氧化活性进行了系统的研究;再将相分离所得水相通过活性炭/硅藻土柱层析分离纯化得到甘油糖苷(GG);通过体外重量法,体表仪器测试法和人永生化角质形成细胞(Ha Ca T)干燥模型对GG的保湿活性进行评价,并通过酶联免疫吸附(ELISA)和RT-q PCR技术对GG的保湿机理进行探究。以期为蔗渣酸化甘油预处理液的综合利用和GG的保湿机制研究提供理论基础。本文的主要结论如下:(1)通过THF萃取预处理液,可得到上相为THF相和下相为水相。THF相在旋蒸、水洗和离心后得到NWL沉淀和上清液,上清液中含有WL和甘油。对上清液进行THF萃取,萃取条件为:时间5 min,次数4次,THF用量为0.25倍上清液(v/v),最终能去除99.26%的甘油,得到WL。WL和NWL的产率分别为38.00%和49.63%。水相物质经过活性炭柱层析分离,在2%乙醇洗脱相中分离得到GG,通过高效液相色谱、液质联用技术和核磁共振谱图分析,鉴定GG中主要成分为甘油木糖苷和甘油葡萄糖苷,含量分别为56.44%和36.49%,GG的产率为68.17%。(2)以碱木质素作为对照,通过傅里叶红外光谱(FTIR)、核磁异核单量子关系谱(HSQC)测定WL和NWL的官能团组成和结构,结果表明WL和NWL具有明显的木质素结构单元特征,在它们的结构中出现甘油基团信号。通过核磁共振磷谱研究木质素羟基的类型和含量,结果表明WL的脂肪族羟基含量较高,是碱木质素的2.3倍,这可能与其水溶性相关,NWL的总酚羟基含量1.39 mmol/g,高于WL和碱木质素。通过凝胶渗透色谱(GPC)对分子量测定,通过热重分析评价木质素的热稳定性,结果表明NWL的分子量较大(Mw=4278 g/mol),分布集中(Mw/Mn=1.86),NWL的高分子量使其具有较高的热稳定性,在390℃到达最大失重速率温度。WL分子量较小且分布不集中(Mw/Mn=2.38),热稳定性较差,说明其中可能含有小分子的酚类物质。通过液质联用对WL中主要的小分子物质进行鉴定,结果表明WL中含有3,4-二羟基-苯甲酸甘油酯、1(2)-O-对香豆酸甘油酯、阿魏酸甘油酯等被甘油修饰的酚类物质。(3)通过DPPH自由基清除能力和氧自由基吸收(ORAC)能力评价WL和NWL的体外抗氧化活性,结果表明NWL的DPPH自由基清除率的EC50为0.82 mg/m L,小于WL(1.57 mg/m L)和碱木质素(2.22 mg/m L),ORCA值为243 mmol TE/100 g,高于碱木质素和WL。说明NWL具有较好的体外抗氧化活性,WL和碱木质素的体外抗氧化能力相似。对WL的细胞抗氧化活性进行评价,结果表明WL能够进入细胞内部发挥抗氧化作用。(4)通过体外重量测量法测定GG的体外吸湿和保湿性能,结果表明GG的吸湿和保湿性能要优于透明质酸(HA)和甘油葡萄糖苷(αGG)。通过仪器法评价GG体表保湿性能,结果表明GG能将皮肤含水量提高60%,并在5 h内维持皮肤水分含量,效果好于HA和αGG。通过Ha Ca T细胞干燥模型对GG的保湿活性进行研究,结果发现GG具有细胞干燥保护作用和干燥损伤修复的作用,能够提高干燥处理后Ha Ca T细胞的存活率。通过ELISA试剂盒检测GG处理对Ha Ca T细胞HA合成量和水通道蛋白3(AQP3)含量的影响,结果发现GG高剂量组的HA合成量比对照组高31.03%,GG中低剂量组AQP3含量为对照组的3倍。通过RT-q PCR技术检测Ha Ca T细胞保湿相关基因表达量的变化。发现GG的保湿机制可能为,一方面上调AQP3基因表达,以提高细胞中AQP3蛋白含量,增加细胞膜的通透性促进细胞内外水分子交换,增加细胞的水合程度,改善皮肤屏障功能;另一方面上调HAS1基因表达,增加HA合成量,以增强细胞的水合能力,同时上调HYL2基因的表达,促进部分HA分解为胶原,胶原通过与蛋白质之间的交联反应形成弹性网状结构能够牢牢锁住水分,增加细胞的保湿效果。
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