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氟喹诺酮类药物是临床和畜牧养殖上极其重要的抗菌药物之一,广泛应用于临床治疗和动物养殖生产实践。近年来,随着质粒介导的喹诺酮耐药基因(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)的出现,喹诺酮耐药问题日趋严重。质粒介导的喹诺酮外排泵基因oqxAB和qepA在动物源或人源菌株中已有较多的报道,在不同来源(动物、食品和人)大肠杆菌中的传播机制和携带oqxAB和qepA的耐药质粒特征尚不明确。本研究以不同来源(动物源、食品源、宠物源以及医院临床)的大肠杆菌为研究对象,分析PMQR基因(主要是oqxAB和qepA)的流行情况;阐明不同来源大肠杆菌中oqxAB和qepA的传播规律和传播机制;分析携带oqxAB和qepA基因多重耐药质粒的特征;为喹诺酮类药物耐药性防控提供基础数据,为指导临床合理用药以及新药研发提供科学的数据支撑。采用琼脂稀释法测试1740株不同来源大肠杆菌对8类抗菌药的敏感性,结果显示,不同来源的大肠杆菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药率最高(80%);其次是对氨苄西林(73%)、四环素(73%)、链霉素(67%)、喹乙醇(64%);随后是头孢噻肟、头孢他啶、新霉素、庆大霉素、安普霉素、氯霉素、氟苯尼考和环丙沙星,耐药率在25%~53%之间;但头孢西丁(7%)、阿米卡星(4%)和粘菌素(11%)耐药率则较低。无论是动物源、食品源还是医院临床大肠杆菌对氨苄西林、四环素的耐药率均较严重,达55%以上。动物源大肠杆菌对链霉素、新霉素、安普霉素、氯霉素、氟苯尼考、黏菌素和喹乙醇的耐药率均高于食品源、宠物源和人源菌株;但对头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶的耐药率均低于人源菌株。值得注意的是猪、鸡源大肠杆菌对喹乙醇的耐药率达95%以上,远超于食品源(39%)和人源(38%)。食品源、人源和猪源大肠杆菌对环丙沙星的耐药率较低,分别为34%、29%、23%,但宠物源和鸡源大肠杆菌却达到50%以上。有趣的是,宠物源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率(27%)最高,远高于动物源、食品源和人源。对随机挑取的1034株不同来源大肠杆菌进行PMQR检测,结果发现oqxAB基因在食品动物源和食品源大肠杆菌中的检出率(22.9%、22.9%)明显高于医院临床和宠物源大肠杆菌的检出率(12.3%、12.0%)。qnrS基因在食品动物源大肠杆菌中的检出率最高(30.3%),其次是在食品源(21.9%),显著高于医院临床和宠物源(7.86%、8.01%)。而qepA在医院临床(4.08%)和宠物源(6.0%)的检出率则要高于食品源(1.41%)和食品动物源(0.07%)。qnrB的检出率在不同来源的大肠杆菌中检出率均较低:宠物源2.0%、食品动物源1.76%、和食品源0.35%,人源大肠杆菌则未检出。所有菌株中均未检测到qnra、qnrc和qnrd。利用脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldelectrophoresispfge)对50株不同来源oqxab阳性大肠杆菌进行亲缘性分析,结果成功将45株oqxab阳性大肠杆菌分为32个型,大部分菌株不存在克隆关系,但在不同动物或人之间以及动物、食品和人源菌间均存在oqxab阳性大肠杆菌的克隆传播现象。通过电转化实验,共获得21株oqxab阳性转化子,且均表现出多重耐药,转化子snj43-1除外。s1-pfge和southern杂交结果显示,21株oqxab转化子中含有1~4个质粒,大小为28~500kb,除snx19-2无杂交信号,4个双质粒转化子有两个杂交信号外,其余16个转化子中oqxab均定位于单一质粒上。21株oqxab转化子中有13株利用复制子分型成功,其中1株为incn型质粒,3株为inchi2型质粒,9株为incf型质粒,包括5株多复制子融合质粒。质粒酶切结果显示,7株分离自猪、鸡或食品的oqxab阳性质粒属于同一rflp型(限制性片段长度多态性),另外2株分离自鸡和病人的oqxab阳性质粒属于同一谱型,表明相似质粒在不同来源大肠杆菌间的水平传播也是oqxab基因流行的原因之一。采用反向pcr和pcrmapping相结合的方式对oqxab阳性转化子进行oqxab基因侧翼序列分析,结果在19株转化子中oqxab基因侧翼均为2个同向插入序列is26,该结构与已报道的人医临床来源或动物源的大肠杆菌或沙门氏菌相应片段序列高度相似,提示插入序列is26对oqxab基因在不同型质粒间的整合和不同来源菌株间的传播扩散发挥了重要作用。利用接合实验成功获得2株不同来源且同时携带qepa和rmtb基因的接合子,均表现出多重耐药。2株接合子中qepa/rmtb均位于f2:a-:b-型质粒,而质粒酶切结果显示,与课题组2008年获得的宠物源接合子3a11-16j携带的f2:a-:b-型qepa/rmtb阳性质粒属于同一rflp型,提示f2:a-:b-型质粒的水平传播是qepa和rmtb在不同来源大肠杆菌间协同扩散的主要原因。通过pacbio测序分析比较oqxab阳性质粒phnzy32的多重耐药质粒结构特征,发现phnzy32属于多复制子融合质粒,包括incfii、incn和incx型复制子,转移区及其毗邻的先导区与f33:a-:b-型质粒高度相似,携带pemki、vagcd、hok-sok和srnbc四种质粒沉溺系统。phnzy32携带两个耐药区,分别含有耐药基因aph(3’)-iia、Δble、oqxab、blatem-1、rmtb、fosa3和blactx-m-55、,以及flor、teta、stra、strb和sul2。推断该质粒可能是以n1-f33:a-:b-质粒phnfp460-1的相似质粒为骨架,整合了包括oqxab基因和复制子在内的incx型质粒片段,以及包括耐药基因flor、teta、stra、str B和sul2在内的20 Kb片段,经过多步插入、重组作用进化形成的。质粒pHNZY32的IncX型复制子区域在来自动物和人的15个oqxAB转化子中检出,推测IncX型质粒可能与oqxAB基因在不同来源细菌间的传播有关。通过鸟枪随机打碎构建文库的方法进行qepA阳性质粒pHN3A11测序,经分析,发现pHN3A11质粒骨架和其他IncFII型F2:A-:B-质粒高度相似,如中国的pHK23a,pFOS-HK151325和pXZ质粒以及加拿大的pC15-1a质粒。质粒pHN3A11序列中存在能提高质粒在垂直传播过程中的稳定性能的编码基因,包括质粒沉溺系统(pemI/pemK,hok/mok/sok)和分配系统(parM、parB、和stbB)。pHN3A11质粒的多重耐药区包括rmtB,qepA,blaTEM-1和dfr基因,上下游插入着若干个完整或截断的插入序列和转座子,如ΔIS1,ΔTn2,ΔintI1,ISCR33,IS26和Tn21。采用PCR和测序的方法研究pHN3A11类似质粒的流行分布情况。发现pHN3A11类似质粒已广泛扩散于中国的宠物源、食品动物源以及养殖环境源大肠杆菌中。综上所述,oqxAB基因在我国不同来源(食品动物、宠物、动物性食品和医院临床)大肠杆菌中普遍流行。垂直传播以及多重耐药质粒和插入序列IS26等可移动元件介导的水平传播共同介导oqxAB基因在动物源、食品源和人源大肠杆菌间流行和传播。而qepA则常与rmtB协同传播,F2:A-:B-型pHN3A11相似质粒是qepA和rmtB在不同来源大肠杆菌间水平传播的主要载体。喹诺酮外排泵基因oqxAB和qepA在不同来源大肠杆菌中的传播扩散,不仅影响兽医临床的防治效果,也对人类健康和公共安全形成潜在威胁。