干眼(dryeye)是指由于泪液的质或量异常，或泪液的动力学异常引起的泪膜不稳定及眼表面的损害，从而导致眼不适等症状的一类疾病[1]。干眼是目前世界和我国最为常见的眼表疾病。流行病学及临床调查发现美国65～84岁的人群中，14.6％(430万)的人患干眼病[2]。我国迄今尚无干眼流行病学的调查结果。但基于我国的卫生条件和环境状况，其发病率可能较文献报道的高，而且，随着环境污染的加重、人们使用电脑的频率的增加，干眼的发病率还会进一步的增加。干眼是一种病因复杂、症状多样，严重影响着人们的生活质量的疾病。但是，目前干眼的诊断较为困难。其原因是由于临床医师缺乏对干眼的认识、诊断标准的准确性和精确性的不足及检查指标变异性较大所致。因此为寻找变异性较小、临床简单易行的检查方法，制定统一的诊断标准已成为目前干眼临床工作的重要课题。 泪液乳铁蛋白[3](1actoferrin，LF)是泪液中由浆液性腺体产生的最主要的抗菌蛋白，而且具有广谱的抗菌、抗病毒、抗氧化作用。泪液乳铁蛋白主要来源于泪腺和副泪腺的腺泡上皮细胞，其含量在很大程度上能反映泪腺的外分泌功能，对于维持眼表的健康状态具有很重要的价值。大量文献证实，干眼与乳铁蛋白含量下降存在相关性，所以泪液中乳铁蛋白的含量是诊断干眼一个客观、敏感的指标。 胶体金(colloidgold)由Faulk和Taytor于1971年引入免疫化学[4]，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。而胶体金标记技术(colloidgoldmarkingtechnique)是利用还原剂将氯化金分子聚合成为具有特定大小的胶体金颗粒(goldparticle，GP)，被生物学大分子(IgA等)包被后，作为一种特异性的探针，用于生物科学各个领域。胶体金免疫层析法[5](GICA)是近几年来国际上发展迅速的快速诊断技术，原理是将胶体金标记的特异的抗体(抗原)，先固定于干燥的硝酸纤维素膜的一段，当该端接触到待检样品后，由于毛细管的虹吸作用，样品沿着膜向前移动，当到达固定有相应抗体(抗原)的区域，样品中相应的抗原(抗体)，即与之反应发生特异性结合，使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 本课题利用胶体金免疫层析法，成功制备了乳铁蛋白试纸条，并且验证了其显色的浓度范围和检测的可重复性，并将其应用于临床，判断其诊断干眼的敏感性和特异性，为临床诊断干眼提供一种简便、快捷并且客观的辅助检查方法。 第一部分乳铁蛋白试纸条的制备1、研究方法：1.1金溶胶的制备：利用0.01％氯金酸水溶液，用柠檬酸三钠还原法制备了金溶胶。并通过分光光度计检查金溶液的吸收峰。 1.2单克隆抗体的胶体金标记：将制备好的金溶胶于适当浓度的单克隆抗体在适当的PH值条件下进行混合，并进行离心和洗涤，完成单克隆抗体的胶体金标记。 1.3多克隆抗体的稀释和PH值调定以及喷膜：将配备好的多克隆抗体装入BIODOT划膜机喷头2，预定位置进行喷膜(硝酸纤维膜)。 1.4二抗的稀释和PH值调定以及喷膜：将配备好的二抗装入BIODOT划膜机喷头1，预定位置进行喷膜(硝酸纤维膜)。 1.5单克隆抗体的标定：将标记好的单克隆抗体铺于玻璃纤维素膜上，并与硝酸纤维膜复合，按4*30mm进行切膜。 1.6乳铁蛋白试纸条的检测：用制备好的乳铁蛋白试纸条检测配制的各个标准浓度的乳铁蛋白，测定该试纸条的显色范围和检测重复性。 2、研究结果：2.1本实验制备了金溶胶，其颜色为红色，直径为40nm。 2.2胶体金标记单克隆抗体，加入的单克隆抗体为20μg/ml，原来的浓缩金标抗体溶液的OD值为7.10D，最大吸收峰540nm。 2.3装配成了乳铁蛋白试纸条，其显色浓度为2～200ug/ml之间。0～5ug/ml浓度范围的检测显示，0、1ug/ml的10个试纸条均为阴性，而2～5ug/ml的10个试纸条均为阳性，显示了较好的重复性。 3、结论：本文第一部分，成功制备了应用胶体金免疫层析法检测乳铁蛋白浓度的试纸条，并测定了其显色范围及重复性，可用于半定量分析溶液状态下的乳铁蛋白浓度，有助于临床上诊断干眼的应用。 第二部分乳铁蛋白试纸条的初步临床应用1、研究方法：1.1选取29例干眼患者以及30例正常对照，分别签署了知情同意书。 1.2所有入选者完成了问卷调查表。 1.3所有入选者进行双眼SchirmerItest、BUT以及荧光素染色检查。 1.4毛细玻璃管法分别采集双眼的泪液，将采得的泪液用PBS按一定比例稀释后，进行乳铁蛋白试纸条的检测，评价其诊断干眼的敏感性和特异性。 2、研究结果：2.1如果泪液按1：800稀释，其诊断干眼的敏感性为22.4％，特异性为91.7％。 2.2如果泪液按1：900稀释，其诊断干眼的敏感性为24.1％，特异性为75.0％。 2.3如果泪液按1：1000稀释，其诊断干眼的敏感性为70.7％，特异性为73.3％。 2.4如果泪液按1：1100稀释，其诊断干眼的敏感性为82.8％，特异性为60.0％。 2.5如果泪液按1：1200稀释，其诊断干眼的敏感性为93.1％，特异性为35.0％。 2.6如果泪液按1：1300稀释，其诊断干眼的敏感性为100％，特异性为11.7％。 3、结论：本部分研究结果表明，利用乳铁蛋白试纸条诊断干眼有较高的应用价值，如果泪液按1：1000稀释，用来诊断干眼，其敏感性和特异性分别为70.7％和73.3％。可以作为诊断干眼的一种辅助检查。 如果泪液按1：1300稀释，其敏感性可以达到95％左右，可以用来筛查干眼。如果泪液按1：800稀释，其特异性可以达到90％以上，可以用来排查干眼。