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膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高和术后易复发等特点。山西省肿瘤医院研发的苏复宁洗液能有效控制膀胱癌术后复发,课题组前期研究发现其抗癌有效成分巴西苏木素(Brazilin)能抑制膀胱癌T24细胞的生长。巴西苏木素处理T24细胞后c-Fos和GADD45β两个基因表达量显著上调,分别过表达这两个基因均能抑制T24细胞活性,推测这两个基因可能为潜在的分子靶标。本文在此基础上,进一步深入研究共表达和共干扰这两个基因后对巴西苏木素抑制T24细胞的影响,通过RNA-seq探索c-Fos和GADD45β在巴西苏木素抑制T2细胞中的信号通路,从而揭示巴西苏木素通过c-Fos和GADD45β抑制T24细胞生长的分子作用机制。本文的主要研究内容和结果如下:1、首先建立可用于筛选siRNA的荧光报告载体系统p-c-Fos-EGFP-N1和p-GADD45β-EGFP-N1,分别对靶基因c-Fos和GADD45β的3条siRNA进行筛选,结果发现siRNA-274对c-Fos的干扰效率最高,为64%,siRNA-638对GADD45β的干扰效率最高,为67%,筛选获得的siRNA片段可用于本文后续基因功能研究实验。2、利用筛选获得的高效siRNA序列在T24细胞中对靶基因进行干扰,结果发现干扰c-Fos和GADD45β均可挽救Brazilin导致的T24细胞死亡(挽救率分别为37.9%和45.7%)。进一步单独过表达这两个靶标基因,发现均能抑制T24细胞生长。通过过表达和干扰正反两方面的实验表明c-Fos和GADD45β是巴西苏木素抑制T24细胞生长的潜在靶标分子。3、采用共表达和共干扰实验探索c-Fos和GADD45β在抑制T24细胞生长中的关系。在T24细胞中共表达靶基因c-Fos和GADD45β后,可显著增加对细胞的抑制作用,细胞死亡率较单独表达c-Fos或GADD45β分别提高28.3%和22.2%,说明这两个基因对T24细胞的抑制具有叠加作用。而利用siRNA干扰时发现,在T24细胞中共干扰靶基因时,与单独干扰c-Fos或GADD45β组对比,可显著提高Brazilin引起细胞死亡的挽救效率(挽救率分别提高41.8%和14.9%)。进一步通过RT-qPCR研究两个基因之间的关系,结果表明过表达c-Fos不引起GADD45β表达水平发生变化;而干扰c-Fos时,也不会影响Brazilin对T24细胞中GADD45β表达的刺激作用,说明干扰c-Fos不影响Brazilin对GADD45β的作用。同样过表达GADD45β不引起c-Fos表达水平发生变化;而干扰GADD45β时,也不会影响Brazilin对T24细胞中c-Fos表达的刺激作用,说明干扰GADD45β不影响Brazilin对c-Fos的作用。结果表明巴西苏木素通过作用于c-Fos和GADD45β两个独立的靶标基因抑制T24细胞生长。4、利用比较转录组学研究巴西苏木素通过c-Fos和GADD45β抑制T24细胞的信号通路。将过表达c-Fos和GADD45β的T24细胞进行转录组测序,与空质粒对照组比较后筛选出差异表达变化显著的基因,经筛选发现c-Fos/control组有289个基因发生显著变化,GADD45β/control组有352个基因发生显著变化。进一步与巴西苏木素处理T24细胞后的数字基因表达谱进行聚类分析,发现c-Fos/Brazilin组有9个共同基因,GADD45β/Brazilin组有8个共同基因,且c-Fos/Brazilin组和GADD45β/Brazilin组之间没有共同基因,进一步说明巴西苏木素是通过c-Fos和GADD45β两个靶基因所介导的不同信号通路抑制T24细胞生长。本文研究了c-Fos和GADD45β两个基因的生物学功能及在巴西苏木素抑制T24细胞中的作用,结果将有助于阐明巴西苏木素抑制膀胱癌T24细胞的分子机制,也为后续抗肿瘤药物的研究提供靶标分子。