目的：本课题组前期研究工作表明，ZWINT1基因存在新的选择性剪接亚型，命名为ZWINT-1isoformc(简称ZWINT-1v4)，并且发现ZWINT-1(ZWINT-1isoforma，简称ZWINT-1v1)及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4在食管癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织。为了探究ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4生物学功能及其作用机制的差异，以及在食管癌的发生和发展中可能存在的作用，本实验分别构建稳定表达ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4的EC109细胞系，并在此基础之上，采用亲和纯化联合质谱分析的方法对可能与两者存在相互作用的蛋白进行差异性分析。
　　方法：将本课题组前期已构建的重组真核表达质粒pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v1-6×His和pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v4-6×His进行再次测序确认后，分别转染EC109细胞，构建稳定表达细胞系。利用Westernblot检测融合蛋白ZWINT-1v1及融合蛋白ZWINT-1v4在转染细胞中的表达情况，采用免疫荧光技术检测重组真核表达质粒的瞬时转染效率。利用嘌呤霉素进行加压筛选，建立稳定表达融合蛋白ZWINT-1v1及融合蛋白ZWINT-1v4的EC109细胞系。通过亲和纯化技术分离与目的蛋白ZWINT-1v1和ZWINT-1v4相互作用的蛋白复合体，并进行质谱检测和生物信息学分析，从而筛选并鉴定ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4的差异性相互作用蛋白。利用Oncomine数据库检索分析可能与ZWINT-1v4存在相互作用的蛋白在食管癌组织及正常组织中的表达情况，从而对新选择性剪接亚型ZWINT-1v4与食管癌之间可能存在的联系进行初步探究。
　　结果：将重组真核表达质粒的测序结果与NCBI提供的ZWINT-1(isoforma，NM_007057.4)参考序列进行比对分析，证实ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4编码序列已成功克隆到真核表达质粒pcDNA3.0-puromycin中。将重组真核表达质粒pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v1-6×His和pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v4-×His分别转染EC109细胞，Westernblot结果显示融合蛋白ZWINT-1v1及融合蛋白ZWINT-1v4在转染细胞中正常表达，免疫荧光结果显示两种重组真核表达质粒的瞬时转染效率均为20%左右。利用含0.5μg/mL嘌呤霉素的培养基进行加压筛选，Westernblot结果显示成功建立了稳定表达融合蛋白ZWINT-1v1的EC109细胞系。通过亲和纯化技术有效地分离出与融合蛋白ZWINT-1v1及融合蛋白ZWINT-1v4存在相互作用的蛋白复合物；经过质谱检测和生物信息学分析，最终筛选并鉴定出一系列ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4的差异性相互作用蛋白。对可能与新选择性剪接亚型ZWINT-1v4存在相互作用的蛋白，利用Oncomine数据库进行检索，其结果显示，除了MAD1L1基因外，TRIP13、TUBG1、RPS6KA3、YES1、SMARCC2、PSMD1、PPP3CA、DNM2、CDC37、ACT等基因在食管癌组织中的表达量均显著高于正常组织。
　　结论：本实验采用亲和纯化联合质谱分析的方法，筛选并鉴定出一系列ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4的差异性相互作用蛋白，为揭示两者生物学功能及其作用机制的差异提供了新的实验和理论。同时，初步探讨了新选择性剪接亚型ZWINT-1v4与食管癌的发生和发展的之间可能存在的联系。