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【实验目的】探究PM2.5自然暴露对卵巢功能的影响及分子机制，验证筛选出的保护性药物虎杖苷对PM2.5所致卵巢损伤的阻遏作用。
【实验方法】首先，将64只8周龄雌性小鼠随机分为两组，分别置于PM2.5高效过滤的洁净空气(filtered air, FA)和不过滤的含PM2.5空气中饲养，即FA组和PM组。于暴露1个月和4个月时进行动情周期监测和产仔实验以评估卵巢内分泌和生殖功能，并于暴露4个月后收集小鼠血清和卵巢组织，通过卵泡计数、酶联免疫吸附实验、末端标记法凋亡检测、转录组测序、免疫组织化学和蛋白免疫印迹等方法进行卵巢储备功能评估和分子机制探索。然后，用PM2.5水溶成分和有机可溶成分干预KGN人颗粒细胞系，进行分子机制验证。紧接着，根据前述分子机制研究和文献综述分析，筛选能阻遏PM2.5暴露所致卵巢功能损伤的潜在保护性药物，并对较有潜力的虎杖苷开展实验验证。将48只8周龄雌性小鼠随机分为4组：对照组(CONT)、PM2.5暴露组(PM)、服用50mg/kg虎杖苷的PM2.5暴露组(PM+PD(L))和服用100mg/kg虎杖苷的PM2.5暴露组(PM+PD(H))。监测体重和动情周期，收集血液和重要脏器进行整体评估及卵巢形态学和分子水平检测，通过卵泡计数评估卵巢储备功能，通过TUNEL、电镜、油红O染色、IHC、WB等进行亚细胞结构观察和分子机制检验。最后，用PM2.5有机可溶成分和虎杖苷干预体外培养的人卵巢皮质组织，进行分子机制的验证。
【实验结果】与FA组相比，①暴露4个月时，PM组小鼠动情周期不规律比例增加，血清E2和FSH显著升高(P<0.05)；②暴露1个月和4个月时，PM组怀孕率和平均产仔数下降，成功交配所需时长增加，并且暴露4个月时，孕鼠平均产仔数和子代第3天体重显著下降(P<0.05)；③PM组始基卵泡、窦卵泡和总卵泡数目显著减少(P<0.05)，始基卵泡比例下降，闭锁卵泡比例显著增加(P<0.05)；④TUNEL示PM组颗粒细胞凋亡增多，促凋亡分子γ-H2AX和BAX以及凋亡终末标志物CleavedCaspase3蛋白表达水平增加(P<0.05)；⑤转录组数据显示，差异表达基因在胆固醇代谢和卵巢甾体激素合成通路富集较多，与卵巢内分泌功能改变关系密切；⑥PM组卵巢氧化磷酸化通路上调，PM组卵巢氧化损伤标志物NTY和4-HNE表达显著增加，抗氧化酶SOD2、NQO1和CYT-C表达下调(P<0.05)；⑦PM组卵巢炎症反应活化增强，IL6和炎症小体复合物组成分子Caspase1表达显著增加(P<0.05)，NFκB通路激活。体外细胞实验也显示，PM2.5可溶成分诱导KGN人颗粒细胞系氧化应激和炎症反应活化，抑制细胞增殖并促进凋亡，而且有机可溶成分对细胞的危害比水溶成分大。第二部分动物实验结果显示：①虎杖苷改善PM2.5暴露小鼠的卵巢内分泌功能，降低动情周期不规则的发生率，减轻血清雌孕激素水平的改变；②与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组始基卵泡、窦卵泡数目和始基卵泡比例增加(P<0.05)；③虎杖苷抑制PM2.5暴露所致的颗粒细胞凋亡，减少卵泡闭锁。与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组γ-H2AX、BAX和CleavedCaspase3蛋白水平降低(P<0.05)；④虎杖苷增强PM2.5暴露小鼠卵巢的自噬水平，与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组自噬底物p62减少(P<0.05)，电镜观察到的异常线粒体和脂滴减少；⑤虎杖苷减轻PM2.5暴露小鼠卵巢和人卵巢皮质组织的氧化应激损伤和炎症反应。与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组氧化损伤产物8-OHdG、NTY和4-HNE表达水平减少(P<0.05)，脾脏重量和脏器指数以及血清IL6浓度下降，卵巢中IL6和Caspase1表达下调，NFκB通路被抑制(P<0.05)，人卵巢皮质培养结果与之一致。
【结论】长期处于PM2.5自然暴露状态会损害卵巢的生殖和内分泌功能，并使卵巢储备功能下降，主要分子机制涉及氧化应激、炎症反应及线粒体途径的凋亡通路的激活。PM2.5可通过这些机制诱导颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁以及甾体激素代谢通路改变。而虎杖苷可通过抑制PM2.5诱导的卵巢氧化应激和炎症反应以及增强细胞自噬水平，减少细胞内受损细胞器和异常脂质的蓄积，抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，减轻PM2.5暴露所致的卵巢功能损伤，保护卵巢储备功能。
【实验方法】首先，将64只8周龄雌性小鼠随机分为两组，分别置于PM2.5高效过滤的洁净空气(filtered air, FA)和不过滤的含PM2.5空气中饲养，即FA组和PM组。于暴露1个月和4个月时进行动情周期监测和产仔实验以评估卵巢内分泌和生殖功能，并于暴露4个月后收集小鼠血清和卵巢组织，通过卵泡计数、酶联免疫吸附实验、末端标记法凋亡检测、转录组测序、免疫组织化学和蛋白免疫印迹等方法进行卵巢储备功能评估和分子机制探索。然后，用PM2.5水溶成分和有机可溶成分干预KGN人颗粒细胞系，进行分子机制验证。紧接着，根据前述分子机制研究和文献综述分析，筛选能阻遏PM2.5暴露所致卵巢功能损伤的潜在保护性药物，并对较有潜力的虎杖苷开展实验验证。将48只8周龄雌性小鼠随机分为4组：对照组(CONT)、PM2.5暴露组(PM)、服用50mg/kg虎杖苷的PM2.5暴露组(PM+PD(L))和服用100mg/kg虎杖苷的PM2.5暴露组(PM+PD(H))。监测体重和动情周期，收集血液和重要脏器进行整体评估及卵巢形态学和分子水平检测，通过卵泡计数评估卵巢储备功能，通过TUNEL、电镜、油红O染色、IHC、WB等进行亚细胞结构观察和分子机制检验。最后，用PM2.5有机可溶成分和虎杖苷干预体外培养的人卵巢皮质组织，进行分子机制的验证。
【实验结果】与FA组相比，①暴露4个月时，PM组小鼠动情周期不规律比例增加，血清E2和FSH显著升高(P<0.05)；②暴露1个月和4个月时，PM组怀孕率和平均产仔数下降，成功交配所需时长增加，并且暴露4个月时，孕鼠平均产仔数和子代第3天体重显著下降(P<0.05)；③PM组始基卵泡、窦卵泡和总卵泡数目显著减少(P<0.05)，始基卵泡比例下降，闭锁卵泡比例显著增加(P<0.05)；④TUNEL示PM组颗粒细胞凋亡增多，促凋亡分子γ-H2AX和BAX以及凋亡终末标志物CleavedCaspase3蛋白表达水平增加(P<0.05)；⑤转录组数据显示，差异表达基因在胆固醇代谢和卵巢甾体激素合成通路富集较多，与卵巢内分泌功能改变关系密切；⑥PM组卵巢氧化磷酸化通路上调，PM组卵巢氧化损伤标志物NTY和4-HNE表达显著增加，抗氧化酶SOD2、NQO1和CYT-C表达下调(P<0.05)；⑦PM组卵巢炎症反应活化增强，IL6和炎症小体复合物组成分子Caspase1表达显著增加(P<0.05)，NFκB通路激活。体外细胞实验也显示，PM2.5可溶成分诱导KGN人颗粒细胞系氧化应激和炎症反应活化，抑制细胞增殖并促进凋亡，而且有机可溶成分对细胞的危害比水溶成分大。第二部分动物实验结果显示：①虎杖苷改善PM2.5暴露小鼠的卵巢内分泌功能，降低动情周期不规则的发生率，减轻血清雌孕激素水平的改变；②与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组始基卵泡、窦卵泡数目和始基卵泡比例增加(P<0.05)；③虎杖苷抑制PM2.5暴露所致的颗粒细胞凋亡，减少卵泡闭锁。与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组γ-H2AX、BAX和CleavedCaspase3蛋白水平降低(P<0.05)；④虎杖苷增强PM2.5暴露小鼠卵巢的自噬水平，与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组自噬底物p62减少(P<0.05)，电镜观察到的异常线粒体和脂滴减少；⑤虎杖苷减轻PM2.5暴露小鼠卵巢和人卵巢皮质组织的氧化应激损伤和炎症反应。与PM组相比，PM+PD(L)/(H)组氧化损伤产物8-OHdG、NTY和4-HNE表达水平减少(P<0.05)，脾脏重量和脏器指数以及血清IL6浓度下降，卵巢中IL6和Caspase1表达下调，NFκB通路被抑制(P<0.05)，人卵巢皮质培养结果与之一致。
【结论】长期处于PM2.5自然暴露状态会损害卵巢的生殖和内分泌功能，并使卵巢储备功能下降，主要分子机制涉及氧化应激、炎症反应及线粒体途径的凋亡通路的激活。PM2.5可通过这些机制诱导颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁以及甾体激素代谢通路改变。而虎杖苷可通过抑制PM2.5诱导的卵巢氧化应激和炎症反应以及增强细胞自噬水平，减少细胞内受损细胞器和异常脂质的蓄积，抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，减轻PM2.5暴露所致的卵巢功能损伤，保护卵巢储备功能。