研究背景胆固醇代谢是肝脏重要的组织特异性生理功能,肝脏在调节机体胆固醇的平衡中起着关键作用。高胆固醇血症多由胆固醇代谢失衡引起,已成为动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素,并且是动脉粥样硬化的最主要诱因。深入研究肝脏胆固醇代谢分子机理将对了解胆固醇代谢失衡和动脉粥样硬化性疾病病理和开发更有效的治疗手段提供有力的生物学依据。近几年越来越多研究显示促甲状腺激素(TSH)与血清总胆固醇水平呈正相关。促甲状腺素激素受体(TSHR)通过与TSH高度特异性相互作用介导其功能。我们之前研究发现,肝脏组织表达功能性TSHR。TSHR是G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员之一。在TSH刺激下,肝脏组织TSHR通过cAMP/PKA/CREB/HMGCR 和 SREBP2/HNF4α/CYP7A1 两条不同的信号通路调节肝脏胆固醇的代谢。除了上述两条G偶联蛋白信号转导途径之外,我们前期的研究揭示,在肝脏组织中还存在着功能未知的TSHR调节通路——β-arrestins(ARRBs)介导的TSHR通路。ARRBs具有双重信号转导活性,一方面它可以介导活化的GPCR脱敏,另一方面它可以启动G蛋白非依赖型的信号传导过程。ARRBs包括ARRB1和ARRB2。他们广泛分布在所有的细胞和组织中,并在TSHR参与的分子机理中扮演着不同的角色。然而,ARRB1和ARRB2在TSH介导的胆固醇代谢中如何发挥作用尚未有详尽的研究报道。在本文研究中,我们探讨了 ARRB1和ARRB2在TSH调控的胆固醇代谢中的可能作用。通过在C57/BL6J小鼠以及肝HepG2细胞中比较ARRBs敲除或敲减导致的胆固醇水平改变,确认其在胆固醇代谢中的关键作用。我们在ARRBs敲除 C57/BL6J(arrb1-KO 和 arrb2-KO)小鼠和ARRB 敲减的 HepG2(ARRB1-KD和ARRB2-KD)细胞系的研究中发现,肝脏组织ARRB1敲除或敲减,胆固醇水平下降。TSH处理HepG2细胞发现,ARRB1敲减导致蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平降低,胆固醇代谢重要转录因子—固醇调控元件结合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein;SREBP2)活性降低,使得 SREBP2 对胆固醇向胆汁酸转化的限速酶—胆固醇7-α羟化酶(CYP7A1)的抑制作用降低。进一步研究发现,应用AKT激动剂能够逆转ARRB1敲减导致的相关信号通路活性改变,从而上调SREBP2水平。我们的研究结果表明ARRB1参与AKT介导的TSH调节胆固醇的代谢途径。TSH可以上调ARRB1表达水平,从而增强AKT磷酸化,上调SREBP2的水平,抑制CYP7A1的表达,减少胆固醇向胆汁酸的转化。研究目的:1.肝脏ARRBs敲除对胆固醇水平的影响。2.肝组织中ARRBs介导TSH调节胆固醇代谢的分子机理。研究方法:1.动物模型(1)ARRB1/2敲除C57/BL6J(arrb1-KO和arrr2-KO)小鼠,由山东大学孙金鹏教授赠送。小鼠喂养:室温23℃,湿度60%,明暗周期12小时,自由饮水和进食。(2)亚临床甲状腺功能减退症(subclinical hypothyroidism,SCH)动物模型。8周龄雄性C57/BL6J小鼠饮水中给予甲巯咪唑(MMI,0.04 mg/kg.d.)抑制甲状腺激素(TH)合成。每周测量体重,MMI的药物剂量根据小鼠体重调整。给药12周后成模。(3)模型动物生化和分子指标分析:小鼠饥饿6小时后应用戊巴比妥钠处死。处死前收集血清,处死后取出肝脏,PBS冲洗后存于液氮。用1251标记放射免疫方法测定血清游离甲状腺激素(FT4)和游离三碘甲腺原氨酸(FT3),ELISA法测定TSH。总mRNA采用Trizol标准方法提取。总蛋白采用RIPA标准步骤提取。蛋白浓度应用BCA法测定。2.细胞模型(1)HepG2细胞培养:HepG2细胞常规培养根据ATCC标准培养方法进行。(2)构建ARRB1/2敲减细胞模型:HepG2细胞培养至70-80%密度时,用CRISPR-Cas9技术得到ARRB1-KD和ARRB2-KD细胞模型,用westemblot来验证敲减效率,并确定最有效的序列。(3)TSH刺激细胞:当HepG2细胞长至70%-80%密度时,更换为无血清培养基过夜,加入4μM bTSH刺激24h,中间选时间点留取样本。(4)AKT激动剂SC79刺激细胞:相应处理的细胞模型,向培养基中加入SC79 24小时,中间选时间点留取样本。3.GloSensorTM cAMP 分析TSHR接受TSH刺激后通过胞内第二信使cAMP转导活化信号,因此胞内cAMP水平改变能反映TSHR活性。GloSensor assay是一种利用生物发光方法检测细胞内cAMP的方法,可检测出细胞应答GPCR上的测试化合物效应产生的cAMP。采用GloSensor assay可分析细胞模型中TSH刺激后胞内TSHR起始的信号通路活性水平。4.胆固醇测定肝脏组织和细胞的游离胆固醇和总胆固醇应用胆固醇分析试剂盒测定,实验步骤参照说明书。用同样本的蛋白浓度来校正胆固醇的含量。5.胆固醇代谢相关蛋白的分子鉴定提取组织和细胞的总mRNA和总蛋白,用于qRT-PCR和westernblot定量分析。6.统计分析数据分析应用SPSS 17.0,表示为均数±SE。Immunoblotting条带用Image J统计。误差线表示标准误(s.e.m)。两组计量资料对比用t检验,多组用方差分析,P<0.05为差异显著性界值。作图软件Origin 9.0,组合软件Adobe Illustrator CS5。结果1.TSH水平升高上调ARRBs表达水平。SCH小鼠血清TSH水平较野生对照组明显升高(p<0.01),而FT4则无统计学差异。在SCH小鼠肝脏组织ARRB1和ARRB2的转录水平均显著上调(ARRB1:p<0.05,ARRB2:p<0.01)。TSH 刺激 HepG2 细胞也发现 ARRB1/2的蛋白水平均增加,其中ARRB2在刺激1-2小时蛋白水平显著增加(p<0.01),ARRB1在刺激12-24小时蛋白水平显著增加(p<0.05)。2.ARBs基因敲除或敲减导致肝脏胆固醇水平下降。arrb1-KO和arrb2-KO小鼠与野生对照小鼠相比,arrb1-KO小鼠肝脏组织总胆固醇水平明显降低(p<0.05),而arrb1-KO小鼠无明显差异。在ARRB1/2-KD细胞模型上也发现ARRB1表达减少与细胞内总胆固醇水平显著降低有关(p<0.05),AR B 表达减少则与此过程无显著相关性。3.ARRBs在TSH介导的肝脏胆固醇代谢中的作用与抑制胆固醇合成和减少转化有关(1)抑制ARRBs可增加肝组织细胞胆固醇合成。我们研究了 ARRBs对胆固醇代谢的合成和转化关键限速酶的影响。在arrb2-KO小鼠肝脏中,HMGCR蛋白水平表达增加(p<0.05),arrb1-KO小鼠肝脏中,HMGCR蛋白水平表达增加不明显;CYP7A1蛋白水平表达在arrb1-KO小鼠肝组织中显著增加(p<0.05)。同样在ARRB1/2-KD细胞实验中,HMGCR蛋白水平表达增加(p<0.05),ARRB1-KD细胞CYP7A1表达水平也有增加(p<0.05),ARRB2-KD细胞CYP7A1表达水平与对照细胞相比无变化,与arrb1-KO和arrb2-KO小鼠结果一致。这些结果表明抑制ARRBs可增加肝组织细胞胆固醇合成。ARRB1敲除或敲减导致CYP7A1表达增加,我们推测ARRB1在肝脏胆固醇转化中可能起着重要的作用。(2)ARRBs参与了 TSHR下游G蛋白介导的信号通路活性调节。为了检测ARRBs表达下调后TSHR信号通路的活化效率,我们采用GloSensor定量分析细胞内cAMP水平。用4μM TSH刺激对照细胞和ARRB1/2-KD细胞,forskolin(腺苷酸环化酶激活剂)和PBS分别作为阳性和阴性对照。结果显示,TSH刺激2小时,ARRB2-KD的cAMP水平升高最明显。ARRB2敲减,cAMP水平升高,可以认为ARRB2参与了 TSH-TSHR-PKA-cAMP信号转导通路活性的调节。(3)ARRBs对TSH刺激下胆固醇代谢关键酶表达水平的调节。采用ARRB1/2-KD细胞模型精确定量分析ARRBs水平与胆固醇代谢酶系水平的相关性。在对照细胞中,TSH刺激后HMGCR的水平增加,同时CYP7A1的表达水平降低;当在HepG2细胞中敲减ARRB1/2后,TSH对HMGCR的作用并没有受到ARRBs敲减的影响。但是在ARRB1-KD细胞,CYP7A1的水平较ARRB2-KD和对照细胞高,提示ARRB1可能在TSH介导的胆固醇转化调节中起更重要的作用。4.TSH刺激胆固醇代谢相关的ARRBs信号通路通过AKTrse8磷酸化调节起作用采用ARRB1/2-KD细胞模型研究ARRBs介导TSH-TSHR信号通路的调节过程。4μM TSH刺激对照细胞时,AKT活化表现为ser308和ser473双位点的磷酸化水平增加。在ARRB1/2-KD细胞,AKT的ser473位点磷酸化水平较对照细胞无明显变化;但是AKT的ser308磷酸化水平明显下降,其中ARRB1-KD细胞更为显著。AKT激动剂SC79处理后CYP7A1蛋白表达水平减少,提示应用AKT激动剂能够逆转ARRB1缺失导致的相关信号通路活性改变。结论ARRB1参与AKT介导的TSH调节胆固醇的代谢途径。TSH可以上调ARRB1表达水平,从而增强AKT磷酸化,上调SREBP2的水平,抑制CYP7A1的表达,减少胆固醇向胆汁酸的转化。