论文部分内容阅读
本文对高活性蜂王浆蛋白的提取、分离、纯化及其抗氧化和免疫活性进行了系列研究。结果如下:以鲜蜂王浆蛋白质为研究对象,通过蛋白质的分离分级及测定各级分蛋白含量和抗氧化性,确定了清蛋白为目标蛋白级分。并采用单因素和正交试验优化清蛋白提取工艺。结果表明,提取液pH值、料液比对清蛋白提取率有显著影响,而温度、提取时间、NaCl浓度影响不显著,最佳提取工艺为pH8.0,温度0℃,料液比1∶20,时间2h,此条件下清蛋白的相对提取率达到87.21%。在最佳提取条件下制备清蛋白提取物,应用化学发光法研究其对羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢的清除作用及对DNA损伤的保护作用。结果显示,清蛋白在体外具有良好的抗氧化活性,其IC50分别为3.81mg/mL、5.16mg/mL、7.43μg/mL和4.34mg/mL。清蛋白提取物对DPPH·的IC50为0.315mg/mL。清蛋白对小鼠肝脏脂质体过氧化也具有一定抑制作用。同时研究了清蛋白提取物对正常小鼠的免疫调节活性,结果表明,清蛋白提取物能显著调节小鼠细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫和NK细胞活性。应用Sephadex G-100凝胶过滤层析、DEAE-52离子交换层析及两种方法结合分离纯化清蛋白,SDS-PAGE鉴定洗脱峰的纯度。清蛋白先过Sephadex G-100凝胶过滤层析,再过DEAE-52离子交换层析的方法能纯化出具有活性的单一蛋白组分RJA-57(royal jelly albumin-57kDa,RJA-57)。经SDS-PAGE、Native-PAGE、SephadexG-100、紫外吸收光谱鉴定其纯度,均表明所制备的RJA-57是单一蛋白组分。并对其体外抗氧化性做了初步研究,结果表明,RJA-57能有效清除DPPH·,保护DNA损伤,其IC50为0.139mg/mL和2.47mg/mL。对小鼠肝脂质过氧化也有抑制作用。RJA-57氨基酸组成分析表明,其含有人体必需的8种氨基酸,其中色氨酸和含硫氨基酸丰富,是一种优质的蛋白质。RJA-57的FT-IR红外光谱显示蛋白质的特征红外吸收峰,且初步判断其β-折叠结构所占比例远大于α-螺旋结构。圆二色谱分析了RJA-57分别在25℃、70℃条件下的二级结构组成,结果显示,两种温度下RJA-57均含有较多的β-折叠和无规则卷曲,且温度升高,α-螺旋、β-折叠比例降低,无规则卷曲比例增大。并利用内源荧光和荧光淬灭研究了RJA-57分子tryptophan(tryptophan,Trp)残基溶液构象行为,结果显示,部分Trp残基暴露于蛋白质分子表面,也有部分包埋于疏水区内。