论文部分内容阅读
第一部分Polybrene对慢病毒载体耳蜗细胞的转染作用目的:观察病毒转染增强剂polybrene的耳毒性作用并进一步探讨其对慢病毒转染耳蜗细胞,特别是转染耳蜗毛细胞的作用。材料和方法:采用新生大鼠耳蜗基底膜培养的方法,应用0.1-10μg/ml polybrene处理耳蜗基底膜24小时,观察毛细胞形态、缺失率,并进一步评估polybrene对耳蜗细胞的安全浓度。其中,采用TUNEL和碘化丙啶染色观察2μg/ml polybrene作用后毛细胞的凋亡与坏死情况。慢病毒载体转染耳蜗细胞效率的测定采用不同浓度的慢病毒载体与耳蜗基底膜共培养24小时后,更换不含病毒载体的新鲜培养液继续培养48小时。评估各组耳蜗细胞转染效率后,选择最适慢病毒浓度,联合应用安全浓度的polybrene,观察polybrene对慢病毒载体转染耳蜗细胞的作用。结果:不同浓度polybrebe基底膜培养24小时发现:对照组毛细胞形态良好,0.1μg/ml组毛细胞形态基本接近对照组。0.5μg/ml组毛细胞纤毛轻度破坏,并出现零散的毛细胞缺失;当浓度增加到1μg/ml时,内外毛细胞纤毛明显倒伏,中度毛细胞缺失。当浓度达2μg/ml和5μg/ml时,毛细胞结构排列紊乱、大量毛细胞缺失,残存的毛细胞纤毛部分或全部丢失,后者更为严重。当浓度增加到10μg/ml,毛细胞罕见。各组内外毛细胞平均缺失率显示:与对照组相比,0.1μg/ml组内外毛细胞虽然有少量缺失,但是差异没有统计学意义(多样本秩和检验,两两比较,P>0.05)。0.5μg/ml polybrebe引起外毛细胞轻度缺失,与对照组相比差异没有统计学意义(多样本秩和检验,两两比较,P>0.05)。浓度超过0.5μg/ml后,各组内外毛细胞缺失率与对照组相比差异均有统计学意义(多样本秩和检验,两两比较,P<0.05)。碘化丙啶染色显示毛细胞细胞核呈碎片状、浓染,TUNEL凋亡检测未见阳性。周围支持细胞胞核形态良好。不同浓度慢病毒转染后平均GFP阳性细胞数目分别为62.75±18.65(1×106 IU),196.83±22.34(5×106 IU),205.42±5.74(1×107 IU),1×107 IU慢病毒联合0.1μg/ml polybrene后平均GFP阳性细胞数目为247.44±13.51,与未联合polybrene相比差异有统计学意义(单因素方差分析,Bonferroni检验,P<0.05)。各组均未见毛细胞被转染。结论:0.1μg/ml polybrene对耳蜗毛细胞较为安全,0.5-10μg/ml polybrene对耳蜗毛细胞损伤呈剂量依赖性,并以细胞坏死方式导致细胞死亡,但对支持细胞无损伤。0.1μg/ml polybrene可以促进慢病毒载体对耳蜗基底膜除毛细胞以外的支持细胞的转染效率,但无论是否联合应用polybrene,慢病毒载体仅转染耳蜗基底膜支持细胞,不能转染耳蜗毛细胞。Polybrene可用于慢病毒载体对耳蜗基底膜支持细胞的转染。第二部分细胞自噬在顺铂耳毒性中的作用目的:探讨在离体耳蜗器官培养条件下,不同浓度顺铂对耳蜗细胞的损伤规律及其机制。材料和方法:采用新生大鼠耳蜗基底膜体外培养技术,应用不同浓度的顺铂与基底膜共培养48小时,荧光显微镜下观察各组毛细胞和螺旋神经节形态,绘制耳蜗毛细胞图并计数毛细胞缺失率,并应用透射电镜观察各组毛细胞与螺旋神经节超微结构,应用免疫印迹检测各组自噬蛋白beclin1表达情况,以及应用10μM顺铂与基底膜共培养24小时、48小时、72小时,通过TUNEL法检测各时间点耳蜗细胞凋亡情况。结果:离体耳蜗器官培养条件下,对照组毛细胞形态良好;10μM顺铂组毛细胞排列紊乱,内外毛细胞约70%毛细胞缺失;100μM顺铂组导致毛细胞形态大量破坏,形成细胞碎片,内外毛细胞缺失达90%以上;与对照组相比,400μM顺铂毛细胞形态良好,数目未见明显缺失。对照组神经纤维束清晰可见,神经节细胞胞体形状规则;10μM组神经纤维大量减少,相对应的神经节细胞亦大量缺失,残留的神经纤维和节细胞形态尚可;100μM组神经纤维和神经节细胞进一步加重,这些神经纤维明显纤细,相对应的神经节细胞胞体形态不规则;与对照组相比,400μM组神经纤维和神经节细胞数目未见明显缺失,神经节细胞胞体形态规则,但胞体体积变小。在透射电镜下,10μM顺铂组见毛细胞和螺旋神经节具有典型的凋亡特征即核固缩、核碎裂;400μM组毛细胞线粒体稍肿胀,其与对照组毛细胞内均可见双侧膜包绕的自噬体,二者的螺旋神经节均未见明显病变。自噬蛋白beclin1表达水平随顺铂浓度增加具有先减少后而增加的趋势。TUNEL检测显示10μM顺铂与基底膜共培养24小时未见毛细胞凋亡,48小时后可见毛细胞大量凋亡,72小时后几乎所有毛细胞发生凋亡。结论:离体耳蜗器官培养条件下,顺铂耳毒性并不是浓度依赖性的,低浓度顺铂对毛细胞和螺旋神经节具有明显损伤作用,这种损伤主要由细胞凋亡引起,而高浓度顺铂未见明显细胞损伤,可能与自噬的激活有关,自噬的激活减缓了顺铂耳毒性,对毛细胞和螺旋神经节具有保护作用。第三部分铜转运蛋白在耳蜗组织中的表达目的:观察铜转运蛋白2在耳蜗组织中的定位表达,并进一步探讨顺铂对铜转运蛋白1和铜转运蛋白2表达的影响。材料和方法:应用耳蜗基底膜分离取材技术,取出生后3-5天的大鼠耳蜗基底膜组织固定,采用铜转运蛋白2免疫荧光染色和鬼笔环肽复染,观察铜转运蛋白2的表达及定位情况。并采用耳蜗器官离体培养技术,离体耳蜗器官与10μM顺铂共培养48小时后,用免疫印迹法检测铜转运蛋白1和铜转运蛋白2的表达情况。结果:毛细胞和血管纹边缘细胞的胞浆内可见铜转运蛋白2免疫荧光染色阳性;免疫印迹法结果显示对照组和10μM顺铂组均可见铜转运蛋白1表达,应用10μM顺铂培养48小时后铜转运蛋白1表达未见明显变化,两组均未检测到铜转运蛋白2表达。结论:铜转运蛋白1和铜转运蛋白2均在耳蜗组织中表达,其中铜转运蛋白2在耳蜗毛细胞和血管纹边缘细胞胞浆内表达。