目的皮肤作为人体最大的器官,其在调节体温、排泄代谢废物以及维持机体内环境稳定等方面均发挥着重要作用。但是,皮肤在日常生活以及战(创、烧)伤中也最易受到损伤。轻度受损的皮肤可以依据其未损伤的细胞与组织为模板,依靠皮肤自身的再生潜力完成其自我修复的过程；但重度大面积损伤的皮肤却丧失其原有的组织结构与功能,皮肤中具备修复潜能的干细胞与组织被严重破坏,其自我修复的潜能也随之丧失殆尽。目前对于大面积深度烧伤的治疗,仍存在诸多困难,如愈合后瘢痕挛缩、供体皮肤来源不足、异体或异种皮的免疫排斥反应等。随着组织工程学的诞生,人们开始应用分子生物学、细胞生物学、组织工程学及医学科学等原理和技术构建各类皮肤替代物。因此,如何能在皮肤损伤的早期利用各项技术和措施来修复与重建损伤皮肤已经成为当前皮肤再生研究的新方向。脱细胞异体真皮基质(acellular allogeneic dermal matrix, allo-ADM)是用理化方法脱除异体表皮和真皮中所有细胞成份,保留细胞外基质的形态结构,并完整保留位于表皮层和真皮层之间的基底膜。其具有完整的胶原三维结构和高生物相容性,是一种良好的真皮替代物,在组织成分上与自体皮肤最相近,可以作为一种理想的皮肤移植物。由于除去了表皮和真皮中可引发被宿主识别的外来细胞成份从而去除了抗原性,移植在受体创面上不发生免疫排斥,为永久性真皮覆盖物。Allo-ADM的存在为受体成纤维细胞血管内皮细胞重新定植和血管新生提供了良好的诱导支架,在allo-ADM中重新定居的成纤维细胞保持产生成熟基质的能力。另外,基底膜的存在非常有利于表皮细胞的生长增殖与分化。但由于基底膜仍具有较强的免疫原性,且异体皮来源主要来源为保存完好的尸体皮,来源十分有限,受到伦理学的制约,且存在有传染疾病的危险,其应用受到极大的限制。异种无细胞真皮基质(xenogeneic acellular dermal matrix, xeno-ADM)也是真皮基质的来源之一,最常用的异种真皮为猪皮。猪皮和人的皮肤在组织结构物性状和免疫方面有许多相似之处,且来源广泛,是异种真皮的最佳材料。Xeno-ADM的制作同allo-ADM的制作基本相同,处理后也去除了诱发免疫排斥反应的细胞成分并且保留了完整的细胞外基质。但由于物种间存在组织蛋白的差异,xeno-ADM的免疫原性要比allo-ADM强。Xeno-ADM的应用存在缺陷：存在较强的免疫原性；血管化速度缓慢；潜在异源性病毒微生物感染风险。我们在以往的研究中发现,在深Ⅱ度烧伤和混合烧伤中,存在一种没有全层坏死的特殊真皮组织,此类组织中可见细胞新陈代谢障碍、细胞功能低下、形态学改变等一系列变化,但在局部环境改善后,具有可逆恢复至正常形态和功能的特点,通常把这部分没有完全坏死的真皮称为变性真皮。由于热损伤等损伤因素存在,变性真皮中含有大量细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)降解物,其具有多种强大的生物学活性,包括诱导炎症反应、诱导细胞迁移、促进细胞增殖等,称为细胞外基质活性肽。细胞外基质活性肽可对伤患产生极大影响,可引起休克、心律失常等致命并发症。以往的经验是将变性皮肤视为焦痂或痂皮,将其切除后覆盖临时覆盖物,近年来有学者提出可行磨痂术以保留变性真皮,可以促进烧伤创面愈合。但其中的细胞外基质活性肽仍然会对伤患产生不利影响。因此,我们提出,能否将烧伤皮肤完全切除,利用组织工程学相关处理措施,祛除其中的不利因素,利用其中的胶原成分和部分活性因子,变成一种新型的真皮支架,使其废物利用,发挥更为合理、促进创面愈合的作用,既可以减少免疫排斥和炎性反应,又能加速烧伤创面的愈合。在本研究中,我们将深度烧伤皮肤进行了组织工程学加工,将真皮基质中的降解物进行无害化处理,制作了深度烧伤真皮基质(Deep-degree burned dermal matrix, DDBDM),对其进行了理学性能及生物学性能初步评价。并选择小鼠作为研究对象,针对其中的细胞因子进行蛋白质芯片实验,明确脱细胞措施对其中的细胞因子有何影响。材料与方法1.深度烧伤动物模型的建立：选用Wistar大鼠、昆明小鼠、Balb/c小鼠作为实验动物,采用恒温恒压烫伤法及恒温水浴烫伤法作为致伤方法,根据致伤深度均匀性及可重复性优选出最佳的致伤方法。2. DDBDM的制备及其物理性能和生物相容性评价2.1 DDBDM的制备方法筛选及其优化：切取烧伤部位皮肤进行胰蛋白酶-Triton X-100方法进行脱细胞处理,按其浓度不同分为A组：0.1%胰蛋白酶、0.1%Triton X-100组,B组：0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton X-100组,C组：0.5%胰蛋白酶、1%Triton X-100组,设定恒温振荡仪于37℃,设定振荡频率为100rpm,设置不同振荡时间1h、2h、4h,使用无菌PBS缓冲液进行振荡漂洗,直至PBS溶液变清亮。根据制得的真皮支架的完整性及其脱细胞的程度进行制备条件的初步筛选。2.2根据DDBDM的大体观察、组织学观察、物理性能检测、生物相容性检测结果进行DDBDM的性能评价。2.2.1 DDBDM的一般性能评价2.2.1.1观察DDBDM的外观、厚度、色泽、弹性情况等指标并记录。2.2.1.2物理性能检测：将DDBDM进行机械强度测定、降解率测定,评价其一般性能。2.2.1.3组织学检查及评价：将DDBDM进行HE染色,观察胶原排列变化情况。2.2.2 DDBDM的生物相容性评价按中华人民共和国国家标准之医疗器械生物学评价方法之第6部分：植入后局部反应试验(GB/T 16886.6-1997)进行小鼠背部植入实验,以ADM为对照,观察DDBDM的纤维化和炎症程度、材料／组织界面炎性细胞类型及其数量和分布、确定DDBDM是否存在坏死及DDBDM溶解程度、肉芽肿形成情况等。3. DDBDM与ADM细胞因子差异分析以Balb/c小鼠为研究对象,将正常皮肤、深度烧伤皮肤、ADM与DDBDM进行细胞因子蛋白芯片实验,研究其中308中细胞因子水平变化,并将其进行统计学分析,观察烧伤及脱细胞过程对其中细胞因子变化的影响作用并分析其相关机制。结果1.恒温恒压电烫仪和恒温水浴烫伤法是稳定的可重复制作深度烧伤动物模型的可靠方法,对于本实验,使用恒温水浴烫伤法能制作更稳定及烫伤深度更均匀的深度烫伤动物模型。2.将深度烧伤皮肤放置于0.25%胰蛋白酶-0.5% Triton X-100混合溶液中,并于37℃恒温振荡仪中,在一定频率下进行脱细胞处理后,可成功制备深度烧伤真皮基质(DDBDM),其一般性能符合真皮替代物的基本条件。3.经过皮下埋植实验证实DDBDM具有良好的生物相容性。4.经细胞因子蛋白芯片实验结果证实：DDBDM中比ADM无过多的有害细胞因子,其中部分细胞因子水平的变化有减少瘢痕形成,促进创面愈合的作用。结论在本研究中,DDBDM的制作方法被最终确定；将ADM和DDBDM中的细胞因子进行比较后发现,DDBDM中没有过多的有害细胞因子,对机体不会产生过多的损害。所以DDBDM可以成为一种理想的真皮替代物材料。如果能有一种有效方法来减少对组织有害的炎性因子,且能够更有效的利用其中的有益细胞因子,那么可以减少其副作用,而且可以提高它的良性作用比如种子细胞的浸润、血管生成和细胞外基质重建。由于DDBDM来源于自体真皮基质,异源性或异体真皮基质的组织不相容性则不存在。然而,本实验有局限性,有关调节关键细胞因子的实验未能实施,所以在体内这些细胞因子如何发挥效应未能得知。而且,应用DDBDM作为真皮替代物来修复烧伤创面,能否加速创面修复也不甚明了。在以后的研究中,将针对某一具体细胞因子进行体内外实验来进一步研究解决这些问题。