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联苯的氯代衍生物多氯联苯(PCBs)是广泛应用的重要工业原料。它是一种严重的环境污染物,对人类有致癌作用。多氯联苯的微生物好氧降解是通过联苯代谢途径进行的。联苯的上游代谢途径需要四个酶的参与,其中2,3-二羟基联苯双加氧酶(BphC)属于外部双加氧酶的一种,它在联苯和多氯联苯的降解中是一个非常关键的酶,其结构,功能和底物特异性等方面已成为该领域研究的热点。Rhodococcus sp. R04基因组测序发现,该基因组中含有8个bphC基因,分别命名为bphCl至bphC8。基于氨基酸序列的相似性和外部双加氧酶的分类,BphCl, BphC2, BphC3, BphC8属于类型I, BphC4, BphC5, BphC6, BphC7属于类型Ⅱ。8个BphC之间的氨基酸序列相似性为11%～77%。根据全基因组序列设计引物,从Rhodococcus sp. R04基因组中扩增出8个bphC基因,将它们分别克隆到表达载体pBV220-His中,并获得了表达。用离子交换一步层析,获得了电泳纯的BphC8, SDS-PAGE和分子排阻层析表明它是一个亚基分子量为35KD左右的同源六聚体。最适温度和最适pH分别为20℃和9.0。我们将bphC2克隆到温度诱导的表达载体pBV220和化学诱导的表达载体pET21a中,构建了重组质粒pBV220-bphC2和pET21a-bphC2。通过表达获得了可溶性的BphC2酶和具有BphC2酶活性的包涵体,上清经离子交换和硫酸铵沉淀获得了电泳纯,包涵体将五步法洗涤获得了电泳纯。在此基础上,对纯化后的可溶性BphC2和包涵体做了热稳定性,化学修饰剂和氧化剂对它们的影响以及确定获得高活性的包涵体的最佳条件和对包涵体的定位。结果表明,与可溶性BphC2相比,包涵体的热稳定性较差,在60℃温浴1h,可溶性部分酶活剩余47%,而包涵体仅剩15%。邻氮二杂菲和过氧化氢对包涵体的抑制作用比较强烈,而高浓度的EDTA (5mmol/L)对包涵体的活性增加了11%,低浓度的DTT (1mmol/L)对包涵体的活性增加了一倍多。对温度诱导型载体pBV220而言,用42℃诱导4h是获得高活性包涵体的最佳条件,对化学诱导型载体pET21a而言,低温(16℃)诱导是获得高活性包涵体的最佳条件。利用诱导表达后的细胞作用底物2,3-二羟基联苯,生成的HOPDA在480nnm处进行荧光激发,在520nm处获得最高荧光值,通过Delta Vision共聚焦显微镜确定包涵体位于细胞质的两极。为了研究Rhodococcus sp.R04中BphC2的C-端区域对酶的活性,热稳定性及分子构象的影响,设计了C-端依次截短1-9个氨基酸残基的突变酶,以野生型酶基因重组质粒pET21a-bphC295为模板,通过PCR扩增获得各突变体的基因片段,并将它们分别克隆到pET21a载体中,经诱导表达后显示随着C-末端截短残基的增多,上清中可溶性目的蛋白的含量越来越少,当截短5个氨基酸残基后,目的蛋白全进入包涵体中。通过测定和比较野生型BphC295和截短1-4个氨基酸残基的突变酶(BphC291, BphC292, BphC293, BphC294)的酶活,热稳定性,动力学常数及寡聚体形式,结果显示与野生型BphC295比较,突变体酶的比活明显降低,野生型酶比活是突变酶BphC291比活的27倍。当截短4个氨基酸残基后酶分子的聚合状态有六聚体变成了四聚体。与野生型酶比较,突变酶BphC292, BphC293, BphC294热稳定性没有多大变化,而突变酶BphC291热稳定性较差,表明酶的稳定性与其分子的完整性密切相关。对动力学参数的分析显示,突变酶与野生型酶相比,底物专一性未发生显著改变,最适底物仍为2,3-二羟基联苯,但突变酶对各底物的的亲和力Km值不断下降,催化速率Kcat/Km也不断减小。可见,酶活性的丧失是由于C-端残基缺失影响了酶对底物的亲和力使反应速度降低所致。