梨果实萼片宿存与脱落过程基因表达谱分析及PsIDA、PsJOINTLESS基因功能的初步研究

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宿萼果(俗称“公梨”)在梨生产中普遍存在。与脱萼果(“母梨”)相比,宿萼果石细胞多、外观及风味品质差,严重影响市场竞争力和经济效益。针对这一产业问题,本研究以宿萼果比例较高的主栽品种‘库尔勒香梨’为研究试材,在研究萼片脱落生理机制基础之上,通过基于高通量测序的RNA-Seq表达谱分析技术,从全基因组表达水平解析脱萼处理和宿萼处理后萼片脱落与宿存状态下表达变化差异显著的基因;同时从‘库尔勒香梨’中克隆了两个与脱落相关的基因,并进行了功能分析,主要研究结果如下:1.花期喷施福星、乙烯利和PBO等植物生长调节剂显著提高了脱萼率,脱萼率较对照提高了24.07%-33.58%。其果萼离区的细胞壁水解酶活性显著高于对照、GA3及BA处理。喷施促进萼片脱落的生长调节剂降低了花萼、子房中IAA.GA3含量及(IAA+GA3)/ABA的比值。2.利用RNA-Seq表达谱测序技术,通过分析‘库尔勒香梨’脱萼处理、宿萼处理和对照间7组不同实验材料的基因表达的总体差异,同时应用生物信息学软件对测序结果进行分析。这些差异表达基因主要参与编码光合作用(光反应、暗反应及电子传递)、碳水化合物代谢(淀粉和糖类代谢等)、植物激素信号通路(植物激素的合成、应答及信号传导)、转录因子调控(MYB基因、MADS-box基因、WRKY基因)、细胞壁水解酶(多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、果胶甲酯酶及扩张蛋白等)等方面的基因。采用荧光定量PCR的方法,验证了表达谱结果的可靠性。通过表达谱的分析,得到了大量可能参与萼片脱落的基因。这些基因的发现,为进一步从分子生物学角度揭示梨果实萼片脱落的分子机制提供了线索。3.根据表达谱测序结果,筛选出1个跟萼片脱落相关的基因,PsIDA。从‘库尔勒香梨’萼片中反转录获取了核酸长度为398 bp的目标基因PSIDA,包含了一个312bp的编码区,共编码104个氨基酸。亚细胞定位表明该基因在细胞核和细胞膜上。构建了含有PsIDA基因特异性片段的超表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及半定量测定基因表达量的方法对带潮霉素抗性的转基因番茄进一步检测,结果证明成功获得了转基因阳性植株。与野生型相比,转基因植株中的花序上的花数目增加,自花结实率提高,个别转基因株系出现了果实形状异常的现象。4.克隆了一个属于MADS-box转录因子家族的梨JOINTLESS基因。该基因全长694 bp,包含了一个672 bp的编码区共编码224个氨基酸,预测分子量为25.439 kDa。该基因受脱萼处理高表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明PsJOINTLESS定位于细胞核。为深入了解所克隆的转录因子的生理功能及与器官脱落的关系,构建了PsJOINTLESS基因过表达载体并成功转化了番茄,筛选到了阳性转基因株系。与野生型相比,转基因番茄花柄的脱落率显著提高,花柄变细,离层细胞数目增加,细胞变小、破裂,排列无序;转基因阳性植株番茄花柄离区的纤维酶活性显著高于野生型;PsJOINTLESS诱导编码脱落相关的转录因子及细胞壁水解酶的基因表达量上升。
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