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研究背景:帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)是最常见的运动神经系统退行性疾病。其病理特征表现为中脑多巴胺能神经元(midbrain dopaminergic neurons,m DANs)数目发生进行性和选择性的减少,残余的多巴胺能神经元胞体内有以α-核突触蛋白(α-Synuclein,α-Syn)为主要组成成分的路易小体(Lewy bodies,LBs)和路易突起(Lewy neurites,LNs)形成。寡聚体状态的α-Syn的毒性作用和聚集状态的α-Syn最终均会引起m DANs的凋亡。Tau属于微管相关蛋白家族,主要分布于神经元的轴突内,其正常生理功能为稳定微管结构和调节微管组装,参与细胞内部的物质转运。越来越多的研究表明Tau也参与了PD的发病过程,Tau也是参与LB纤维聚集的一种组成成分,与α-Syn有共定位的现象,并且能够相互促进聚集。但是,二者之间如何相互作用以及该相互作用在PD发病机制及病理过程的影响仍未明了。因而,本文利用三转基因型小鼠模型,观察不同表达水平的Tau(高表达,正常表达,半剂量表达,以及不表达)对特异性表达在中脑的A53T突变型α-Syn介导的神经毒性作用的影响。目的:1.研究不同表达水平的Tau对α-Syn聚集的影响。2.研究不同表达水平的Tau对α-Syn介导的神经毒性作用的影响。3.进一步探索α-Syn和Tau在体内相互作用的可能机制。方法:1.三转基因型小鼠的构建:将以pituitary homeobox 3(Pitx3)为中脑组织特异性启动子的携带有四环素反式作用因子(tetracycline transactivator,t TA)的小鼠(即Pitx3-t TA基因knockin小鼠,下简称Pitx3小鼠),和携带有四环素操纵子(tetracycline operator,tet-O)-A53T突变型人α-Syn的转基因小鼠(即Tet-O-A53Tα-Syn小鼠,下简称A53T小鼠),分别与human-Tau(h Tau)小鼠和Tau-/-小鼠交配,得到所需的双转基因小鼠:Pitx3/h Tau小鼠和Pitx3/0/Tau+/-小鼠,以及A53T/h Tau小鼠和A53T/0/Tau+/-小鼠。然后再将Pitx3/h Tau小鼠和A53T小鼠交配,A53T/h Tau小鼠和Pitx3小鼠交配,得到目的基因型小鼠:Pitx3/A53T/h Tau小鼠;将Pitx3/0/Tau+/-小鼠和A53T/0/Tau+/-小鼠交配,得到目的基因型小鼠:Pitx3/A53T/0/Tau+/+小鼠,Pitx3/A53T/0/Tau+/-小鼠和Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠。2.行为学检测:利用滚轮实验、抓力实验和旷场实验,对雄性三转基因型小鼠及其正常对照——非转基因型(non-transgenic,n Tg)小鼠分别在2,6,12和18月龄时进行行为学检测分析。3.利用免疫组织化学的方法对三转基因型小鼠及n Tg小鼠的中脑部位:黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNC),腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)和红核后核区(retro-rubral field,RRF)的m DANs的标记物——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞进行计数统计分析。4.利用免疫荧光实验检测三转基因型小鼠及n Tg小鼠中脑部位的α-Syn,钙离子结合受体分子-1(ionized calcium-binding adaptor molecule-1,Iba1),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),微小白蛋白(parvalbumin,PV),神经元核抗原(neuronal nuclei,Neu N),微管相关蛋白1A(microtubule-associated protein 1A,MAP1A)和突触后密度蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)等的表达情况。5.利用Jade-C和Tunel染色检测三转基因型小鼠及n Tg小鼠中脑部位细胞的死亡和凋亡情况。利用Nissl染色标记神经元。6.利用Western blot检测三转基因型小鼠及n Tg小鼠在2,6,12和18月龄时,中脑部位的Tau,TH,高分子量α-Syn(HMW-α-Syn),129位点丝氨酸磷酸化的α-Syn(phospho-Ser129-α-Syn,p Ser129),MAP1A和PSD-95的表达。7.利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)实验探究α-Syn和MAP1A是否具有直接相互作用关系。结果:1.三转基因型(Pitx3/A53T/0/h Tau,Pitx3/A53T/0/Tau+/+,Pitx3/A53T/0/Tau+/-,Pitx3/A53T/0/Tau-/-)小鼠自出生后均表现出明显的震颤、步态不稳等帕金森病样症状,其体重值自1月龄起显著地低于n Tg小鼠。行为学检测实验结果表明三转基因小鼠的行为能力普遍弱于n Tg小鼠。其中,抓力结果显示三转基因型小鼠前后肢的抓力值都明显低于n Tg小鼠,但三转基因型小鼠之间并没有显著差别;滚轮实验表明三转基因型小鼠的平衡协调能力较弱,其中Pitx3/A53T/0/Tau+/-小鼠自6月龄起,相比于其他三转基因型小鼠有更弱的趋势;旷场实验结果显示出Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠在12月龄时出现焦虑样的高水平方向的活动症状。2.三转基因型小鼠中脑部位(SNC、VTA和RRF)的TH+细胞数目相比于n Tg小鼠,均有显著的减少。其中,SNC和VTA部位的减少更明显,2月龄时,三转基因型小鼠SNC部位和VTA部位的TH+细胞分别减少约20%和30%(p<0.001);至18月龄时,三转基因型小鼠SNC部位和VTA部位的TH+细胞则分别减少约50%和60%(p<0.001);而RRF部位的减少自6月龄起开始表现出明显差异(p<0.05),12月龄起差异性更为显著(p<0.001);但各三转基因型小鼠之间的TH+细胞数目并没有显著差异。利用Western blot检测各组中脑部位TH蛋白表达含量的实验也同样发现,三转基因型小鼠的TH表达水平自2月龄起相比于n Tg小鼠就已显著降低(p<0.001),但三转基因型小鼠之间并没有显著差异。3.α-Syn在三转基因型小鼠m DANs的胞质、胞核及轴突均有明显的表达。在对各基因型小鼠的HMW-α-Syn检测发现,三转基因型小鼠自6月龄起在中脑部位就能检测到HMW-α-Syn的表达,在12和18月龄时,与n Tg小鼠相比,三转基因型小鼠中脑部位HMW-α-Syn的表达显著增多(p<0.001),而Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠有表达更多的趋势。然而,各基因型小鼠中脑内p Ser129α-Syn的表达水平并没有显著性差异。4.Jade-C和Tunel染色的检测结果显示,自12月龄起,9三转基因型小鼠黑质网状部(substantia nigra pars reticulata,SNR)都出现有不同程度的细胞凋亡现象,其中,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠的凋亡细胞数目更多。而对各基因型小鼠SNR部位的星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(Iba1)的活化状态的检测发现,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠在2月龄时即有明显的胶质细胞激活现象。5.与n Tg小鼠相比,三转基因型小鼠SNR部位的PV+神经元表达量较少。其中,Pitx3/A53T/0/h Tau,Pitx3/A53T/0/Tau+/+,Pitx3/A53T/0/Tau+/-小鼠的PV+神经元数目没有明显差异和变化,并可存活至18月龄以上。而Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位的PV+神经元则在12和18月龄时出现大量丢失,相较于n Tg小鼠,其PV+神经元数目显著减少(p<0.001),亦明显少于其他三转基因型小鼠(p<0.05)。6.在各三转基因型小鼠的SNR部位,Tunel+细胞同时为Nissl+,说明在三转基因型小鼠SNR部位凋亡的细胞是神经元;在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位,其PV+神经元丢失前(6月龄时),Neu N+与PV+共染;PV+神经元丢失后(12和18月龄时),Neu N+与Tunel+表达高度共定位,而在其他三转基因型小鼠SNR部位,Neu N+很少表达,且与Tunel+不共定位。说明在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位,PV+神经元的大量丢失可能经历了由Neu N+到Tunel+的过渡阶段,Neu N+表达可能是SNR部位PV+神经元退变的指示性标记。7.在各三转基因小鼠的SNR部位,α-Syn主要围绕着PV+神经元聚集表达。其中,在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠中,α-Syn的聚集随年龄逐渐增多,而PV+神经元则显著减少。在纹状体部位,α-Syn也主要聚集于PV+投射纤维周围,而Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠纹状体部位的投射纤维的数量也明显减少。8.Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠中脑部位的MAP1A蛋白表达水平在2和6月龄时均高于其他基因型小鼠,但在12和18月龄时则明显下降至最低。而其他三基因型小鼠的MAP1A蛋白表达水平基本恒定,与n Tg小鼠相比没有明显差异,并且随年龄也没有明显变化。免疫荧光实验结果发现在SNR部位,MAP1A+与PV+共定位;其中,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠自12月龄起,SNR部位的MAP1A发生明显退变,表达显著减少;其他基因型小鼠至18月龄,MAP1A的形态和表达仍没有明显改变。9.与n Tg小鼠相比,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠中脑部位的PSD-95蛋白表达水平自2月龄起即发生明显减少(p<0.01);而在其他三基因型小鼠则至6月龄时才出现显著减少(p<0.01)。免疫荧光实验发现Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠在2月龄时,SNR部位的PSD-95就已发生退变,而其他三基因型小鼠则在12月龄时,SNR部位的PSD-95才发生退变。结论:1.Tau含量的减少会加重Pitx3/A53T小鼠的行为学障碍,但Tau完全缺失进一步导致Pitx3/A53T小鼠出现焦虑样症状。2.Tau含量的减少会加速α-Syn聚集,并且加剧A53Tα-Syn在SNR部位介导的神经退变。3.在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠的SNR部位,PV+神经元发生显著的进行性细胞凋亡,并可能经历了由PV+到Neu N+再到Tunel+的退变至死亡的过渡过程。而在其他三转基因型小鼠的SNR部位,发生细胞凋亡的主要是PV-神经元。4.在SNR部位,PV+与MAP1A+呈现共定位染色。自12月龄起,随着A53Tα-Syn聚集的加剧,Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位早期补偿Tau缺失的MAP1A表达显著减少;这可能是造成PV+神经元大量丢失,导致Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠表现出明显焦虑样症状的主要原因,提示MAP1A可能具有促进PV+神经元存活的保护作用。5.A53Tα-Syn的聚集会导致PSD-95表达显著减少。在Pitx3/A53T/0/Tau-/-小鼠SNR部位发生PSD-95退变要早于其他三转基因型小鼠,并且早于MAP1A的退变,提示PSD-95退变可能是导致MAP1A发生退变的上游机制。