目的:电压门控性钠通道（Voltage-gated Sodium Channels,VGSCs）是哺乳动物体内常见的跨膜蛋白。VGSCs既是可兴奋性细胞中的基本信号分子,又是局部麻醉剂和抗癫痫药物的分子靶点。中枢神经系统中主要表达四种亚型Na_V1.1,Na_V1.2,Na _V1.3及Na_V1.6,其中钠通道亚型Na_V1.1广泛表达于脑内兴奋性和抑制性神经元的胞体和轴突起始段。Na_V1.1的C-末端包含一段特殊氨基酸序列（1901¹917）,这段氨基酸序列为典型的钙调蛋白（Calmodulin,CaM）结合序列,称为IQ（isoleucine and glutamine）基序。IQ基序与CaM的结合不仅能够影响钙信号的传导,而且在细胞内钙浓度发生变化时能够改变通道的活性。Ca²⁺是哺乳动物生理活动中的重要信号因子,且对细胞内的生理活动具有重要的调节作用,如调节蛋白的翻译修饰和神经信号的释放等。CaM作为哺乳动物体内常见的调节因子,能够结合Ca²⁺发挥调节通道活性的作用。CaM分子由两个同源结构域组成,分别为N-lobe和C-lobe,每个结构域上存在两个能够结合Ca²⁺的EF-hand。N-lobe和C-lobe通过α-linker连接并且在结构上高度相似,但C-lobe对Ca²⁺的亲和力是N-lobe的3-10倍。研究表明,Ca²⁺/CaM能够调节VGSCs的活动,但Ca²⁺/CaM对Na_V1.1的具体调节机制尚不明确。CaM同时也是Ⅱ型钙调蛋白依赖性激酶(Ca²⁺/CaM-dependent kinase Ⅱ,CaMKⅡ)激活因子。CaMKⅡ是一种随细胞内Ca²⁺浓度升高而激活的多功能丝氨酸和苏氨酸的蛋白激酶。CaMKⅡ本身的活化以及后续通过苏氨酸残基286（Thr286）的自磷酸化维持活性的特质被认为在突触可塑性中发挥关键作用。CaMKⅡ对VGSCs的磷酸化能够起到动态调控离子通道的表达、功能和定位的作用。目前,Na _V1.1亚型氨基酸序列共有28个已鉴定出的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。已鉴定出的磷酸化位点主要位于α亚基的C-末端。然而,CaMKⅡ磷酸化作用对CaM调节Na_V1.1的影响尚未阐明。本研究应用蛋白纯化、分子模拟和Pull-down技术揭示了CaM调节Na_V1.1的作用机制及CaMKⅡ磷酸化作用对其调节作用的影响,揭示钙/钙调蛋白/Ⅱ型钙调蛋白激酶对VGSCs的调节新机制,为神经系统疾病如癫痫、疼痛等的钠通道相关发病机制奠定坚实的理论基础和实验依据。方法:1.cDNA构建和基因突变以人类Na_V1.1 cDNA为模板,通过PCR技术构建Na_V1.1 IQ基序（IQ,a.a.1901-1917）的cDNA。人源CaM及其截短蛋白N-lobe（a.a.2-80）和C-lobe（a.a.76-148）克隆自HEK293细胞。CaMKⅡ T286D突变体以大鼠cDNA为模板构建完整表达。本文中所有突变体均使用Quickchange TM试剂盒（QIAGEN）构建。构建完成的DNA插入到pGEX-6P-1 H320表达载体进行表达纯化。2.重组GST融合蛋白的表达和纯化将载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）中以表达靶蛋白作为谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合蛋白。大肠杆菌菌液于LB液体培养基37℃培养过夜。向菌液中加入1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG）继续孵育4小时。应用超声技术裂解细胞膜以获取GST融合蛋白。使用谷胱甘肽琼脂糖4B beads（GS-4B,GE Healthcare）与融合蛋白孵育并纯化。使用PreScission酶（GE Healthcare）酶切CaM及其突变体连接GST区域从而得到CaM及其突变体的纯化蛋白。使用BCA蛋白质定量试剂盒来测量通过浓度—密度校准曲线计算的纯化蛋白质的浓度。所有纯化蛋白-20℃环境保存。3.GST pull-down测定将GST融合IQ或其突变体（2-4μg）固定在GS-4B上并与CaM或其突变体于300μL Tris缓冲液体系中4°C孵育4小时。不同Ca²⁺浓度条件下进行四组平行试验。将蛋白复合物重悬于5×SDS-PAGE上样缓冲液中并在15%SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。使用考马斯亮蓝R（Commassie Brilliant Blue,CBB）进行蛋白质染色。通过Photoshop、ImageJ软件定量灰度水平。通过相应蛋白质的矫正系数及分子质量转化为蛋白质的摩尔量。磷酸化作用组:GST-IQ固定于GS-4B珠子后（40μL）在含有0.4μM CaMKⅡT286D,1 mM MgCl₂,and 1 mM Na₂ATP的反应体系中30°C作用30分钟以实现磷酸化反应。去磷酸化作用组:加入5个单位/ml小牛肠道碱性磷酸酶（CIP;New England Biolabs,Ipswich,MA,USA）于反应体系中,37°C环境作用30分钟。4.分子对接基于同源Na_V1.2 IQ结构域晶体结构,利用Discovery Studio 2017软件,构建出Na_V1.1 IQ的同源3D构型。基于Ca²⁺/CaM-Ca_V1.2 IQ复合体,构建出CaM N-lobe和C-lobe。利用Discovery Studio软件中Dock Proteins协议,我们模拟了Na _V1.1 IQ与CaM及N-lobe和C-lobe之间的分子对接。使用ZDOCK协议将Na_V1.1IQ结构域对接到CaM的N-结构域和C-结构域上,然后使用RDOCK协议进一步细化10个最佳结果。5.统计分析使用SigmaPlot 12.0软件绘制CaM（或其突变体）与IQ结合的拟合曲线。拟合曲线选用Hill方程计算:一点拟合模型Y=B_max·X/（K_d+X）或两点拟合模型Y=B_max1·X/(K_d1+X)+B_max2·X/(K_d2+X),其中B_max1,B_max2,K_{d 1}和K_{d 2}分别表示总B_max和K_d,X代表游离配体的浓度,K_d代表表观解离常数,B_max是每个结合位点的最大结合量。数据用平均值±标准误（n=4）表示。使用SPSS 22.0软件应用单因素方差分析检验方法分析数据,P<0.05认为具有统计学差异,P<0.01认为具有显著统计学差异。结果:1、本实验成功构建CaM和Na_V1.1 IQ质粒并检测到CaM与Na_V1.1 IQ的结合作用。2、本实验成功合成CaM和Na_V1.1 IQ突变体及CaM截短蛋白,并进行分离纯化。3、体系中有钙离子存在时,Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ的结合随着CaM浓度和Ca²⁺浓度的升高而升高。4、当体系中不存在钙离子时,apoCaM(Ca²⁺free form calmodulin)与Na_V1.1 IQ基序的结合量明显高于Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ基序的结合量。5、CaM与Na_V1.1 IQ突变体IE或EQ的结合均消失。6、在CaM突变体与Na_V1.1 IQ的结合中,CaM₁₂在无钙条件下与Na_V1.1 IQ结合量最高,CaM₃₄在500nM钙浓度下与Na_V1.1 IQ结合量最高,而CaM₁₂₃₄在四种钙浓度下与Na_V1.1 IQ的结合量相似。7、无钙条件下,CaM截短蛋白C-lobe与Na_V1.1 IQ的结合参数B_max和K_d均高于N-lobe,而存在钙离子时N-lobe与Na_V1.1 IQ结合的参数高于C-lobe。8、分子对接结果显示CaM野生型与Na_V1.1 IQ结合的参数:ZDock 12.78,E_RDock-30.7219kcal/mol。N-lobe与Na_V1.1 IQ结合的参数为:ZDock 11.28,E_RDock-23.3091kcal/mol。C-lobe与Na_V1.1 IQ结合的参数为:ZDock 10.66,E_RDock-26.2142kcal/mol。9、CaMKⅡ介导的钠通道磷酸化作用可增加Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ域的结合。10、将Na_V1.1 IQ序列上潜在的磷酸化位点突变为A后,CaMKⅡ介导的磷酸化作用不能增加Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ域的结合。结论:1、体系中有钙离子存在时,Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ的结合具有浓度依赖性和钙离子依赖性。2、相比Ca²⁺/CaM,当体系中不存在钙离子时,Apocalmodulin(Ca²⁺free formcalmodulin)对通道具有更高的亲和力且优先与Na_V1.1 IQ基序结合。3、C-lobe为ApoCaM与Na_V1.1 IQ结合的主要结构域,而N-lobe为Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ结合的主要结构域。4、野生型CaM与Na_V1.1 IQ的结合具有最小的自由能,是最稳定的结合形式。5、由于CaMKⅡ是特定的多功能丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶,我们推测Ca²⁺/CaM与Na_V1.1 IQ域增加的结合是由于Na_V1.1 IQ氨基酸序列T1909、S1918和T1934中存在一个或多个磷酸化位点。本研究揭示钙/钙调蛋白/钙调蛋白激酶对VGSCs的调节新机制,为离子通道相关神经系统疾病如癫痫、疼痛等的发病机制以及VGSCs亚型特异性与CaM结构相关药物靶点的探寻奠定坚实的理论基础和实验依据。