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子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)是女性最常见的恶性肿瘤之一,据文献报道,子宫内膜癌的发病率逐年上升。近 20 年关于子宫内膜癌的治疗有进展,但在仍存在问题,晚期子宫内膜癌患者仍然存在着治疗效果差、5 年生存率低的问题。由正常子宫内膜演变为子宫内膜癌是一个漫长的过程,寻找子宫内膜癌发生的早期分子变化,从分子水平逆转肿瘤细胞的恶性行为,对子宫内膜癌的防治至关重要。自 1997 年一种新的抑癌基因 PTEN 被发现以来,已经被证实在多种恶性肿瘤中都有突变,是继 p53 之后又一重要的抑癌基因。目前文献报道在子宫内膜癌中的突变率为 26%～80%,是子宫内膜癌中突变率最高的基因,也是该肿瘤占主导地位的突变基因,更进一步的研究表明在子宫内膜癌前病变中PTEN的突变率为18%～55%,因此,PTEN 基因突变是子宫内膜癌的早期分子事件,在子宫内膜过度增生发展至子宫内膜癌中起着重要作用。本课题的目的是构建重组野生型 PTEN cDNA 的复制缺陷腺病毒,并由其介导,将野生型 PTEN cDNA 转入人子宫内膜癌细胞 RL95-2 中,研究外源性 PTEN 的表达对 RL95-2 细胞生物学行为的影响。本研究可为临床诊断和治疗子宫内膜癌提供新的思路和理论基础。目前,通过腺病毒介导野生型 PTEN cDNA 作用于子宫内膜癌的研究,国内尚未见报道。 课题研究的主要内容包括:(1) 野生型 PTEN cDNA 的重组腺病毒载体质粒AdEasy-PTEN cDNA(Ad-PTEN cDNA)的构建;(2)PTEN cDNA 重组腺病毒 Ad-PTEN的产生、鉴定和滴度测定;(3) Ad-PTEN 介导的 PTEN cDNA 在 RL95-2 细胞中的表达鉴定;(4) Ad-PTEN 用于子宫内膜癌基因治疗的体外研究,即外源性野生型 PTENcDNA 的表达对 RL95-2 细胞的生长、增殖和凋亡的影响。 3<WP=8>第二军医大学 硕士研究生毕业论文 方法:1.用限制性内切酶 KpnⅠ、XhoⅠ将 PTEN cDNA 自 pcDNA3.0 PTEN cDNA质粒中酶切下来,由 T4 DNA ligase 联接到穿梭载体 pShuttle-CMV 上;2.穿梭质粒pShuttle-CMV-PTEN cDNA PmeⅠ酶切、去磷酸化,然后与质粒 pAdeasy-1 一起电穿孔进入大肠杆菌 BJ5183,进行同源重组制备重组腺病毒载体质粒 pAdeasy-PTENcDNA。3. PacⅠ酶切质粒 pAdeasy-PTEN cDNA,胶回收后获得的腺病毒基因组 DNA,用脂质体转染的方式转染 HEK293 细胞(腺病毒包装细胞),产生复制缺陷型重组腺病毒 Ad-PTEN,扩增病毒并测定病毒滴度。4. Ad-PTEN 感染人子宫内膜癌细胞 RL95-2,用反向聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹分析(Western-Blotting)两种方法鉴定 PTEN cDNA 的表达。5.X-gal 染色方法测定腺病毒转染效率。6. RL95-2 细胞表达外源性 PTEN cDNA 后生长、增殖实验,包括台盼蓝染色活细胞计数绘制生长曲线,MTT 实验测定细胞增长抑制率,流式细胞分析仪(FCM)测定细胞周期。7.PTENcDNA 的表达诱导 RL95-2 细胞凋亡,包括核 DNA 片断化实验(DNA ladder),Caspase3 检测,细胞膜 PS 外翻实验。 结果:1.重组质粒 pShuttle-CMV-PTEN cDNA 经双酶切和 DNA 序列测定鉴定证实,野生型 PTEN cDNA 片段序列以正确方向插入穿梭载体。2.经 PacⅠ酶切和 DNA序列分析证实,穿梭质粒 pShuttle-CMV-PTEN cDNA 与腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1在大肠杆菌 BJ5183 中成功发生同源重组,产生重组腺病毒载体 pAdeasy-PTEN cDNA。3.重组腺病毒载体转染 HEK293 细胞 7～10 天后可见细胞变圆、肿胀,呈葡萄串状、并有少量浮起等细胞病变现象(CPE)。此时收集细胞重悬于 PBS 中,经四次反复冻融获得的上清中含有大量重组腺病毒颗粒 Ad-PTEN。4.重组腺病毒的鉴定: PTENcDNA 重组腺病毒基因组 DNA 为模板的 PCR 产物具有预期的大小的 DNA 片段,提示重组腺病毒基因组DNA具有 PTEN cDNA序列。5.提取重组腺病毒Ad-PTEN感染的RL95-2细胞总 RNA 进行 RT-PCR,结果提示,该重组腺病毒感染后的宿主细胞具有 PTEN cDNA对应的 mRNA 表达;Western-Blotting 方法鉴定 PTEN 蛋白 在 RL95-2 细胞中有表达。TCID50法测定重组腺病毒 Ad-PTEN 的滴度为 5×109pfu/ml。 6.腺病毒转染效率是目前常用的基因转移方法中较高的一种,本实验测得 Ad-PTEN 最佳感染复数为50。7. 经台盼蓝染色活细胞计数后绘制细胞生长曲线,见经 Ad-PTEN 感染的细胞生长速度明显低于空载体病毒 Ad-CMV 感染及未经病毒感染的 RL95-2 细胞 4<WP=9>第二军医大学 硕士研究生毕业论文(P<0.01),而空载体 Ad-CMV 感染后的细胞与未经感染的 RL95-2 细胞比较,生长速度减慢,但无统计学差异(P>0.05);MTT 实验,证实外源性 PTEN cDNA 的表达后的 RL95-2 细胞吸光度 A 值明显低于对照组(P<0.01),病毒对细胞生长的抑制率与对照组相比明显增加(P<0.01),并随时间的延长,这种抑制作用逐渐加强;FCM 检测出,感染 Ad-PTEN 后的 RL95-2 细胞 G0-G1期细胞比例明显增多,而 S 期 G2-M期的细胞减少(P<0.05);以上实验说明,外源性野生型 PTEN cDNA的表达抑制RL95-2细胞的生长增殖,将细胞周期阻滞在 G1期。8. RL95-2 ?