流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的严重危害人畜健康的一种虫媒传染病。病毒进入宿主细胞是感染早期的关键环节,病毒和细胞的不同,病毒进入细胞的方式和途径也不同。本研究建立了Real-time RT-PCR检测日本乙型脑炎病毒的方法,并应用该方法对日本乙型脑炎病毒入侵细胞的内吞途径进行了初步研究。1. Real-time RT-PCR检测JEV方法的建立本文根据GenBank登录的JEV (SA14-14-2)序列,设计合成了一对特异性引物,构建了JEV质粒标准品,建立了实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)检测JEV的诊断方法。通过检测10倍系列稀释的JEV标准质粒模板显示,该方法的灵敏度能达到15 copies.对不同浓度的质粒标准品进行组内和组间重复性实验,其变异系数(CV)均小于5%,显示该方法具有良好的重复性；对乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)等病毒进行扩增,结果显示该方法对JEV具有高度特异性。该方法建立的标准曲线为：Y=-0.3007X+10.53,拟合度r2=0.997,PCR循环效率为96.53%；研究结果表明,该方法快速、灵敏度高、特异性强、重复性好且能实时定量检测,可用于JEV分离鉴定、JEV感染疑似病例检测、JEV感染定量检测研究及其分子流行病学调查。2.日本乙型脑炎病毒入侵BHK-21细胞的内吞途径初步研究本试验选用氯丙嗪、制霉素和细胞松弛素D三种药物分别处理细胞,以阻滞网格蛋白介导内吞途径、细胞膜穴样内陷途径和巨胞饮途径,然后进行JEV感染实验,通过Real-time RT-PCR方法测定感染后1 h、12 h、24 h细胞内的病毒拷贝数,结果显示：与仅实施感染实验、未进行药物处理的对照组比较,三个药物处理组的细胞内病毒拷贝数,在感染后各时相点均呈现不同程度的下降,其中氯丙嗪处理组下降最为明显,感染后1 h、12 h、24 h细胞内病毒拷贝数分别下降了59.58%,53.34%,61.35%；而细胞松弛素D和制霉素处理组仅有少量下降。在感染后1 h、12 h和24 h,细胞松弛素D组细胞内病毒拷贝数分别下降了23.59%,30.77%,30.14%；制霉素组细胞内病毒拷贝数分别比对照组下降了35.56%,34.40%,34.40%。试验结果表明：JEV主要利用网格蛋白介导内吞途径进入BHK-21细胞。