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大熊猫和朱鹮是世界濒危野生兽类及鸟类的旗舰物种.利用分子生物学技术,对因癫痫和遗传性弱视症导致的神经元损伤具有保护及再生作用,以及视神经通路的发育、分化和受损视觉通路具有修复作用的相关基因,开展克隆、表达和活性鉴定之研究,将为通过基因工程技术实现其疾病治疗之目标奠定基础.这对于促进大熊猫和朱鹮圈养种群之现有疾病治疗体系层次的提高,改善种群现有的健康状况,具有重要的理论意义和实用价值.神经营养因子(Neurotrophic factors,NTFs)是一类由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的能促进中枢和外周神经分化、生长和存活的活性蛋白质.该蛋白在神经系统的发育和正常生理功能的维持等方面起着重要作用.目前,已知的神经营养因子有三个家族:神经生长因子(Neurotrophins,NTs)家族、胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)家族和睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)家族.该论文经引物设计与合成后,利用PCR技术分别自大熊猫和朱鹮的基因组中克隆了GDNF基因和NTs基因家族各成员成熟肽的完整编码序列.通过序列分析发现,这些基因在进化上是保守的.继后,将各成熟肽完整编码序列克隆至pGEX-4T-3表达载体,并经IPTG诱导进行原核生物表达,获得了大熊猫神经生长因子(NGF)和神经营养素4(NT-4),以及朱鹮脑源性神经营养因子(BDNF)及此二动物GDNF的重组表达蛋白.利用SDS-PAGE、GST酶活性及Western杂交等技术初步证明了所获得的重组表达蛋白为GDNF基因和NTs基因家族各成员之编码蛋白.最后,对重组表达蛋白经Glutathione Sepharose 4B MicroSpin Column亲和纯化后,进行大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)神经营养因子的活性鉴定,发现其能够诱导神经细胞分化产生突触,即具有预期的生物学活性,表明所获表达蛋白为大熊猫NT-4及朱鹮BDNF基因所表达的重组蛋白质.目前,虽然对人之癫痫与视神经病变类疾病的基因治疗尚处于探索阶段,而动物在此领域的工作尚未起步,但该文所完成的大熊猫和朱鹮神经营养因子(NTFs)基因家族的克隆、表达及活性鉴定工作,无疑为后续的深入研究奠定了基础.此外,利用神经生长因子NT-3及NT-4基因的保守性,结合线粒体DNA上的序列和其它传统分类学资料,对大熊猫及小熊猫的分类地位进行了探讨,认为应将小熊猫单独列为一科,大熊猫与小熊猫关系较远,应划入熊科.