[研究背景]子宫内膜异位症(Endometriosis,Ems)是指具有生长能力的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆粘膜以外的身体其他部位异常生长,虽然是一种良性激素依赖性疾病,但其表现的浸润、转移、复发和种植生长都是一种恶性生物学行为表现,成为难治之症,被称为“良性癌症”。临床症状多样,主要的临床表现为痛经、盆腔包块、不孕和性交痛等,严重影响妇女的身心健康及生活质量,现已成为生育年龄妇女的多发病、常见病。然而其发病机制目前尚不完全清楚,至今文献报道有多种学说,被广泛接受的传统的三种学说为：经血逆流学说、体腔上皮化生学说及淋巴和静脉播散学说,但传统的学说均存在一定的局限性,不能完全解释Ems的发病机制。由Sampson提出“经血逆流”是一个非常经典的学说,但是它不能解释为什么80%～90%的妇女都有经血逆流,却只有10%～15%的妇女发生内异症,说明经血倒流只是诱因；体腔上皮化生学说缺乏充分的实验及临床依据；淋巴和静脉学说无法说明子宫内膜可通过淋巴和静脉向远处传播,而盆腔外内异症的发病率又极低这一现象。随着免疫学及分子生物学技术的发展,Ems的病因学研究在遗传易感性、免疫学机制、血管生成机制、细胞凋亡、环境因素、细胞外基质等方面都有较大的进展。近年来,细胞的增殖与凋亡失衡学说已成为人们研究的热点。细胞凋亡在Ems作用机制表现：1、内膜细胞凋亡能力降低2、异位细胞增殖能力增强3、细胞的增殖和凋亡失衡导致异常细胞增殖。细胞凋亡受肿瘤抑制因子：PTEN、P53等调控,有研究证实,PTEN是PI3K/Akt通路的上游基因,PTEN能调节NF-kB的活性,它的失活可通过PI3K/Akt信号转导途径激活NF-κB,促进对细胞抗凋亡的调节,从而抑制细胞凋亡。NF-κB是一种真核生物转录因子,在炎症反应、免疫应答、应激反应、细胞凋亡及病毒复制等的调节中起主导作用,是凋亡反应关键的调控因子,能上调多种基因和细胞因子的表达,促进细胞增殖,阻止细胞凋亡而诱发Ems、PTEN是一种重要的调控细胞增殖和凋亡的信号转导分子,在细胞增殖周期中,主要参与细胞周期的调控,发挥抑制细胞过度增殖和促进凋亡的作用。PTEN在Ems中的缺失,促凋亡能力减弱从而使细胞增生和凋亡之间的平衡破坏,导致这些细胞的种植、生长,促发EMS。目前NF-κB、 PTEN在肿瘤方面的研究比较多,Ems具有类似肿瘤的种植、浸润和高复发性等恶性生物学行为,因此我们思考NF-κB和PTEN在Ems中的表达情况及其临床意义。[研究目的]采用SP免疫组织化学技术检测正常子宫内膜、Ems患者在位内膜、异位内膜中NF-κB和PTEN蛋白的表达情况,探讨NF-κB和PTEN在Ems中表达；探讨NF-κB和PTEN与Ems临床病理特征的关系；分析NF-κB和PTEN在Ems中的表达是否具有相关性,从而探讨细胞增殖与凋亡失衡学说机制在Ems的作用,为Ems的治疗提供新的策略及方向。[材料与方法]1.临床资料实验组：收集2011年2月～2012年2月在南方医科大学附属南方医院妇产科因Ems行腹腔镜手术治疗并术后均经病理学确诊的病例40例,取其异位内膜组织及在位内膜组。患者年龄20-46岁,平均(31.63±5.01)岁；其中增殖期27例,分泌期13例；根据1985年美国生育学会修正的子宫内膜异位症分期标准(r-AFS)进行分期,Ⅰ-Ⅱ期24例,Ⅲ～Ⅳ期16。对照组：收集子宫畸形、卵巢冠囊肿和原发性或继发性不孕症患者行手术治疗并排除Ems的正常子宫内膜组织共30例作为对照组,年龄18-43岁,平均(32.57±5.65)岁,刮取的子宫内膜均由病理证实为正常的子宫内膜,其中增生期内膜19例,分泌期内膜11例。分别取Ems患者的异位内膜(A组)、在位内膜(B组)和子宫畸形、卵巢冠囊肿和原发性或继发性不孕症患者的正常子宫内膜(C组)。所有患者均月经周期正常,近六个月未接受过性激素治疗,并且未经过内异症药物治疗,无其他内外科疾病,无恶性肿瘤史。增生期和分泌期的划分依据月经周期及病理特征所见。2.方法先行HE病理形态学观察,明确切片是否能纳入实验,同时确定各组内膜月经周期分期。标本制成4μm厚切片,捞片后置烤箱65℃2h取出,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为空白对照,以已知阳性反应的组织切片作为阳性对照,采用SP法免疫组织化学技术染色,按试剂盒操作说明进行,DAB显色,苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片。以检测正常子宫内膜、异位及在位内膜中NF-κB、PTEN蛋白的表达情况。3.结果判读采用OLYMPUS-BX51正置荧光显微镜观察染色结果,光学显微镜下NF-κB染色阳性信号为腺上皮细胞胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒,PTEN染色阳性信号为腺上皮细胞及间质细胞胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒,每张切片先在低倍镜(10×10)下筛选出阳性表达较强的区域,然后在高倍镜(40×40)下随机选择5个不连续视野进行拍照,经OLYMPUS-DP2-BSW全自动图像分析系统进行彩色图像的采集与存储。用image pro-plus6.0专业图像分析软件对NF-κB及PTEN蛋白的表达情况进行半定量分析,计算出每张切片的平均光密度值(mean optical density, MOD),MOD=sum(IOD)/sum(area)。MOD值越高,表达越强。4.统计方法本实验所得数据资料采用SPSS13.0医用统计学软件进行分析,实验数据先行F正态性检验,若符合正态分布或近似正态分布,结果以x、s表示,同种组织中增生期与分泌期表达比较采用两样本t检验,不同组织间表达比较用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。采用均数t检验和单因素方差分析(ANOVA)在三组内膜中,NF-κB和PTEN的表达是否具有统计学差异；NF-κB和PTEN的相关性采用Pearson相关分析法,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]13组内膜中NF-κB的表达1.1表达部位NF-κB主要表达于腺上皮细胞的细胞浆,间质细胞微弱表达,呈棕黄色颗粒。1.2表达强弱NF-κB在异位、在位内膜及正常内膜中的MOD值分别为0.202±0.010、0.141±0.009和0.080±0.010。NF-κB在三组内膜中表达强弱依次为异位内膜>在位内膜>正常内膜,其差异有显著统计学意义(p<0.01)。23组内膜中PTEN的表达2.1表达部位PTEN表达位于腺上皮细胞及间质细胞的细胞浆,呈棕黄色颗粒弥漫性分布。2.2表达强弱PTEN在异位、在位内膜及正常内膜中的MOD值分别为0.030±0.011、0.082±0.011和0.151±0.012,在三组内膜中表达强弱依次为异位内膜<在位内膜<正常内膜,其差异有显著统计学意义(p<0.01)。3表达与内膜分期的关系NF-κB在异位内膜、在位内膜及正常内膜中,其增生期和分泌期的表达差异均无统计学意义(P>0.05),而PTEN在正常内膜及在位内膜中的表达分泌期高于增生期,其差异有显著统计学意义(p<0.01),在异位内膜中增生期及分泌期的表达无统计学意义(P>0.05)。4NF-κB与PTEN两者表达的相关性异位内膜、在位内膜组NF-κB与PTEN的表达呈显著性负相关(r=-0.945P<0.01；r=-0.735P<0.01),正常内膜中NF-κB与PTEN的表达无明显相关性(r=0.034P=0.858)。[结论]1、异位内膜中NF-κB表达增强提示NF-κB在正常子宫内膜组织中处于不断激活和失活的有序调控中,Ems发病可能与NF-κB的过度激活相关;PTEN表达减弱提示PTEN促进细胞凋亡,PTEN表达下降使异位内膜细胞的抗凋亡性增强并引起细胞周期调控机制改变,正是这种凋亡性的变化导致逆流的子宫内膜得以异位存活和种植。2、NF-κB在异位内膜、在位内膜及正常内膜中,其增生期和分泌期的表达差异均无统计学意义(P>0.05),提示NF-κB表达与月经周期无关,不随月经周期的改变而改变；PTEN在正常内膜及在位内膜中的表达分泌期高于增生期,提示表明PTEN基因可能参与了调节子宫内膜的周期性变化,在异位内膜中增生期及分泌期的表达无统计学意义(P>0.05),且显著低于正常子宫内膜及在位内膜的表达,提示PTEN基因持续性表达缺失可能是子宫内膜异位症的发病机制之一。3异位内膜和在位内膜NF-κB表达与PTEN表达呈显著负性相关,正常子宫内膜NF-κB表达与PTEN表达无明显相关性,其具体机制可能与P13K/Akt细胞信号传导途径有关。