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肝癌（Liver cancer，LC）是发病率和致死率极高的恶性肿瘤，高转移高复发是肝癌临床整体治疗现状不佳的重要因素。目前大量研究致力于遏止肝癌转移复发以提高其诊治水平，降低其死亡率。其中，伴随线粒体氧化代谢所产生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）与肿瘤转移复发的相关研究显示，一方面ROS可以通过损害线粒体基因、激活肿瘤相关通路等方式促进肿瘤进展；另一方面，ROS积累过量可能使线粒体等细胞器甚至细胞受到损伤，从而抑制肿瘤进展。ROS在肿瘤转移复发中呈现出的双向性和复杂性，可能与抗氧化系统的调节有关之外，还可能与细胞通过线粒体自噬（Mitophagy）清除多余的、损伤的线粒体调节ROS，并且维持线粒体功能和细胞自身稳态相关。故从线粒体自噬的角度进一步讨论ROS对肿瘤的影响，能够为抗肝癌复发转移研究提供重要探索方向。
目的：选取影响肝癌ROS及线粒体自噬相关药物：间-氯苯腙羰基氰化物（carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）、巴伐霉素（Balf-A1）、二甲双胍（Metformin）等为实验工具，以Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L等四种肝癌细胞系为实验对象，研究ROS与Mitophagy对肝癌转移侵袭的作用以及相互关系，探索两者在抗肿瘤转移复发中的重要价值。
方法：（1）通过对临床样本进行蛋白质组学测序分析，并联合生物信息学富集分析确定影响肝癌复发转移关键因素的亚细胞定位。①收集2010年至2017年间于成都某三甲医院初诊且进行肝癌根治性切除术患者组织样本，手术日起5年内预后良好肝癌患者组织样本确立为对照组（n=6），手术后2年内转移复发致死患者的组织样本确立为实验组（n=6）；②对收集的组织样本进行蛋白质提取、BCA浓度定量、TMT标记、馏分获取、PHnano-HPLC-MS/MS分析。采用TMT全蛋白质组学定量分析及统计学处理，对所有样本的蛋白质光谱≥2的样品定义为特定蛋白，进行蛋白质定量；使用medians对Mascot搜索结果进行平均和量化，以倍比差异＞1.2或＜0.83且显著性水平P<0.05为条件定义差异表达蛋白；③将差异表达的蛋白质肽段对应的基因进行通用名化，上传至数据库比对分析，以富集分数大于5.0为截点截取数据进行生物信息学富集分析，寻找肝癌转移复发关键的亚细胞定位。
（2）选取实验用肝癌细胞系。肝癌细胞（Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L）经过细胞复苏、细胞换液、细胞传代、细胞冻存，收集足够数量的细胞用于具体实验，并进行细胞株保种保存。
（3）CCK实验检测不同药物处理后的各肝癌细胞系进行生长抑制率。①取对数期生长状态良好的细胞制备单细胞悬液，按照104个/孔加入至含10%的胎牛血清的DMEM完全培养基，接种于96孔板；②细胞接种8h贴壁后，按照实验设计设置空白组、对照组、药物组（每组设置不少于3个复孔）加入培养基及药物，培养24h；③去除上清，加入含10%CCK的DMEM培养液，孵育1h，在450nm波长的酶标仪上完成检测；④计算细胞生长率或生长抑制率并绘制图形。⑤实验设计为分别用以下5组药物作用于不同肝癌细胞系（Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L）检测生长抑制作用：A.不同浓度CCCP（10、20、30、40μM）对细胞生长抑制作用；B.Caspase抑制剂Z-VAD-FMK（10μM）、CCCP（25μM）、Z-VAD-FMK（10μM）联合CCCP（25μM）讨论抗凋亡后细胞生长抑制情况；C.NAC（5mM）、CCCP（25μM）、CCCP（25μM）联合NAC（5mM）讨论抗ROS改变后细胞生长抑制情况；D.Balf-A1（5nM）、CCCP（25μM）、CCCP（25μM）联合Balf-A1（5nM）讨论抗自噬抑制后细胞生长抑制情况；E.Metformin（1mM）、CCCP（25μM）、CCCP（25μM）联合Metformin（1mM）讨论自噬增强后细胞生长抑制情况。
结果：（1）肝癌复发转移致死和预后良好患者的癌组织经蛋白组学测序分析，共获取差异表达的基因365个；对365个基因去除冗余后生物信息学分析，结果来源于UP_KEYWORDS数据库﹑GO数据库﹑UP_SEQ_FEATURE数据库3个数据，富集结果显示：术后肝癌转移复发的亚细胞定位指向线粒体。
（2）CCCP作用Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L四种肝癌细胞后：①CCK检测结果显示，CCCP药物作用明显抑制了4种肝癌细胞的生长，且其生长抑制作用与CCCP浓度呈剂量依赖性；②10μM Caspase广泛抑制剂Z-VAD-FMK与25μM CCCP联合作用于以上4种肝癌细胞，CCCP的生长抑制作用并未被Z-VAD-FMK所逆转；③流式细胞技术检测细胞周期结果显示，CCCP（25μM）对不同转移潜能的肝癌细胞均有周期停滞作用，但4种肝癌所表现的停滞不完全一致，Hep3B细胞G2%增加，Huh7细胞和MHCC97H细胞S%减少、G1%和G2%增加，MHCC97L细胞S%减少、G1%增加；④CCCP（25μM）作用4种肝癌细胞后，穿过小室的细胞数量明显减少。
（3）25μM CCCP、5mM NAC及两者联合使用，作用于Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞后：①CCCP诱导肝癌细胞ROS增高，NAC添加后ROS降低；②NAC显著逆转了CCCP诱导的生长抑制作用；③Transwell结果显示，NAC显著逆转了CCCP诱导的肝癌细胞侵袭和迁移能力降低，并且这4种不同转移潜能的肝癌细胞反应一致。④流式细胞术结果显示，NAC显著逆转了CCCP诱导线粒体数量减少以及膜电位降低；⑤Western Blot结果显示，A.CCCP诱导ROS升高并未激活凋亡相关的标志物PARP和Caspase-3，同时NAC降低ROS对PARP和Caspase-3活性变化无影响；B.CCCP诱导ROS升高，显著降低了线粒体翻译相关蛋白MTIF3、GFM1、MTRF1以及TOM20的表达，而NAC添加后可以逆转CCCP的作用；C.CCCP升高LC3II，增加了P62，下调了Parkin、Beclin、ATG5表达，NAC则逆转了这些变化；⑥激光共聚焦显微成象结果显示：CCCP药物的加入明显降低了肝癌细胞线粒体的数量，NAC逆转了线粒体数量的减少。
（4）5nM Baf-A1、1mM Metformin、25μM CCCP、5mM NAC组合使用作用于MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞后：①自噬抑制剂Baf-A1和自噬诱导剂Metformin的使用均显著抑制了肝癌细胞的生长；两者分别联合CCCP使用后，发现Metformin对CCCP生长抑制作用有逆转作用；②激光共聚焦显示，1mM Metformin显著逆转了CCCP诱导的膜电位下调作用；③Western Blot结果显示，Metformin显著升高了Parkin、Atg5表达的表达；④Transwell结果显示，Metformin显著逆转了CCCP对肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L的迁移抑制作用。
结论：线粒体是肝癌复发转移与否的关键因素，与肝癌转移复发密切相关。体外细胞实验证明，CCCP诱导肝癌细胞ROS剧增，损伤了线粒体的功能、降低了线粒体数量、阻止了线粒体的动力学平衡，导致肝癌细胞侵袭和迁移能力下降；（3）通过Metformin启动线粒体自噬，CCCP的线粒体功能损伤得到一定修复，同时肝癌细胞的侵袭能力得到一定恢复。
综上，本研究结果明确了线粒体损伤对抗肝癌细胞转移具有重要价值，线粒体自噬对维持肝癌细胞转移能力具有重要的作用。线粒体自噬通过修复ROS所致线粒体损伤，维持肝癌细胞侵袭迁移能力。
目的：选取影响肝癌ROS及线粒体自噬相关药物：间-氯苯腙羰基氰化物（carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）、巴伐霉素（Balf-A1）、二甲双胍（Metformin）等为实验工具，以Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L等四种肝癌细胞系为实验对象，研究ROS与Mitophagy对肝癌转移侵袭的作用以及相互关系，探索两者在抗肿瘤转移复发中的重要价值。
方法：（1）通过对临床样本进行蛋白质组学测序分析，并联合生物信息学富集分析确定影响肝癌复发转移关键因素的亚细胞定位。①收集2010年至2017年间于成都某三甲医院初诊且进行肝癌根治性切除术患者组织样本，手术日起5年内预后良好肝癌患者组织样本确立为对照组（n=6），手术后2年内转移复发致死患者的组织样本确立为实验组（n=6）；②对收集的组织样本进行蛋白质提取、BCA浓度定量、TMT标记、馏分获取、PHnano-HPLC-MS/MS分析。采用TMT全蛋白质组学定量分析及统计学处理，对所有样本的蛋白质光谱≥2的样品定义为特定蛋白，进行蛋白质定量；使用medians对Mascot搜索结果进行平均和量化，以倍比差异＞1.2或＜0.83且显著性水平P<0.05为条件定义差异表达蛋白；③将差异表达的蛋白质肽段对应的基因进行通用名化，上传至数据库比对分析，以富集分数大于5.0为截点截取数据进行生物信息学富集分析，寻找肝癌转移复发关键的亚细胞定位。
（2）选取实验用肝癌细胞系。肝癌细胞（Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L）经过细胞复苏、细胞换液、细胞传代、细胞冻存，收集足够数量的细胞用于具体实验，并进行细胞株保种保存。
（3）CCK实验检测不同药物处理后的各肝癌细胞系进行生长抑制率。①取对数期生长状态良好的细胞制备单细胞悬液，按照104个/孔加入至含10%的胎牛血清的DMEM完全培养基，接种于96孔板；②细胞接种8h贴壁后，按照实验设计设置空白组、对照组、药物组（每组设置不少于3个复孔）加入培养基及药物，培养24h；③去除上清，加入含10%CCK的DMEM培养液，孵育1h，在450nm波长的酶标仪上完成检测；④计算细胞生长率或生长抑制率并绘制图形。⑤实验设计为分别用以下5组药物作用于不同肝癌细胞系（Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L）检测生长抑制作用：A.不同浓度CCCP（10、20、30、40μM）对细胞生长抑制作用；B.Caspase抑制剂Z-VAD-FMK（10μM）、CCCP（25μM）、Z-VAD-FMK（10μM）联合CCCP（25μM）讨论抗凋亡后细胞生长抑制情况；C.NAC（5mM）、CCCP（25μM）、CCCP（25μM）联合NAC（5mM）讨论抗ROS改变后细胞生长抑制情况；D.Balf-A1（5nM）、CCCP（25μM）、CCCP（25μM）联合Balf-A1（5nM）讨论抗自噬抑制后细胞生长抑制情况；E.Metformin（1mM）、CCCP（25μM）、CCCP（25μM）联合Metformin（1mM）讨论自噬增强后细胞生长抑制情况。
结果：（1）肝癌复发转移致死和预后良好患者的癌组织经蛋白组学测序分析，共获取差异表达的基因365个；对365个基因去除冗余后生物信息学分析，结果来源于UP_KEYWORDS数据库﹑GO数据库﹑UP_SEQ_FEATURE数据库3个数据，富集结果显示：术后肝癌转移复发的亚细胞定位指向线粒体。
（2）CCCP作用Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L四种肝癌细胞后：①CCK检测结果显示，CCCP药物作用明显抑制了4种肝癌细胞的生长，且其生长抑制作用与CCCP浓度呈剂量依赖性；②10μM Caspase广泛抑制剂Z-VAD-FMK与25μM CCCP联合作用于以上4种肝癌细胞，CCCP的生长抑制作用并未被Z-VAD-FMK所逆转；③流式细胞技术检测细胞周期结果显示，CCCP（25μM）对不同转移潜能的肝癌细胞均有周期停滞作用，但4种肝癌所表现的停滞不完全一致，Hep3B细胞G2%增加，Huh7细胞和MHCC97H细胞S%减少、G1%和G2%增加，MHCC97L细胞S%减少、G1%增加；④CCCP（25μM）作用4种肝癌细胞后，穿过小室的细胞数量明显减少。
（3）25μM CCCP、5mM NAC及两者联合使用，作用于Hep3B、Huh7、MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞后：①CCCP诱导肝癌细胞ROS增高，NAC添加后ROS降低；②NAC显著逆转了CCCP诱导的生长抑制作用；③Transwell结果显示，NAC显著逆转了CCCP诱导的肝癌细胞侵袭和迁移能力降低，并且这4种不同转移潜能的肝癌细胞反应一致。④流式细胞术结果显示，NAC显著逆转了CCCP诱导线粒体数量减少以及膜电位降低；⑤Western Blot结果显示，A.CCCP诱导ROS升高并未激活凋亡相关的标志物PARP和Caspase-3，同时NAC降低ROS对PARP和Caspase-3活性变化无影响；B.CCCP诱导ROS升高，显著降低了线粒体翻译相关蛋白MTIF3、GFM1、MTRF1以及TOM20的表达，而NAC添加后可以逆转CCCP的作用；C.CCCP升高LC3II，增加了P62，下调了Parkin、Beclin、ATG5表达，NAC则逆转了这些变化；⑥激光共聚焦显微成象结果显示：CCCP药物的加入明显降低了肝癌细胞线粒体的数量，NAC逆转了线粒体数量的减少。
（4）5nM Baf-A1、1mM Metformin、25μM CCCP、5mM NAC组合使用作用于MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞后：①自噬抑制剂Baf-A1和自噬诱导剂Metformin的使用均显著抑制了肝癌细胞的生长；两者分别联合CCCP使用后，发现Metformin对CCCP生长抑制作用有逆转作用；②激光共聚焦显示，1mM Metformin显著逆转了CCCP诱导的膜电位下调作用；③Western Blot结果显示，Metformin显著升高了Parkin、Atg5表达的表达；④Transwell结果显示，Metformin显著逆转了CCCP对肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L的迁移抑制作用。
结论：线粒体是肝癌复发转移与否的关键因素，与肝癌转移复发密切相关。体外细胞实验证明，CCCP诱导肝癌细胞ROS剧增，损伤了线粒体的功能、降低了线粒体数量、阻止了线粒体的动力学平衡，导致肝癌细胞侵袭和迁移能力下降；（3）通过Metformin启动线粒体自噬，CCCP的线粒体功能损伤得到一定修复，同时肝癌细胞的侵袭能力得到一定恢复。
综上，本研究结果明确了线粒体损伤对抗肝癌细胞转移具有重要价值，线粒体自噬对维持肝癌细胞转移能力具有重要的作用。线粒体自噬通过修复ROS所致线粒体损伤，维持肝癌细胞侵袭迁移能力。