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目的：NPC（Nasopharyngeal Carcinoma,鼻咽癌）是中国头颈部常见的恶性肿瘤之一，多为低分化鳞癌，恶性程度较高。中国NPC发病率居世界首位，每年新发病例约占世界新发病例的65%。随着放疗技术的发展和辅助化疗的实施，NPC治疗后的5年总体生存率约80%，但治疗后的局部复发和远处转移仍是NPC患者死亡的主要原因。深入探讨NPC复发和转移的分子机制及寻找新的肿瘤分子标志物是当前的研究重点，对提高患者生存率有着重要的临床意义。HOXA13（Homeobox A13,同源盒基因A13）基因是核转录因子HOX（Homeobox Gene,同源盒基因）家族A簇成员，目前有研究发现HOXA13在肿瘤中存在异常表达，可能参与调控肿瘤细胞的恶性生物学行为。但HOXA13在NPC发生和发展中是否有作用还未见相关报道。长链非编码RNA HOTTIP（HOXA Transcript At The Distal Tip,HOXA远端转录本）是HOXA基因5端的转录物，有研究证实HOTTIP可通过靶向调控HOXA13表达从而影响肿瘤的进展。本课题组前期研究发现HOTTIP在NPC中起着促癌基因的作用，沉默NPC细胞中的HOTTIP后HOXA13的表达显著降低。通过查阅文献及前期研究本课题组推测HOTTIP是通过调控HOXA13表达从而促进NPC细胞的恶性生物行为。本实验基于前期实验和HOXA13的研究现状，将HOXA13作为研究对象，利用公共数据库和临床样本分析HOXA13在NPC中是否存在差异表达，进而利用慢病毒转染技术分别上调和抑制NPC HNE1、CNE1两株细胞中HOXA13的表达，分析各组细胞中迁移侵袭相关分子Snail（Zinc-finger Transcription Factor Snail,蜗牛蛋白）、MMP-2（Matrix Metallopeptidase-2,基质金属蛋白酶-2）的表达差异，探讨HOXA13表达失调对NPC增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力的影响及分子机制，为将来研究NPC新的治疗靶点提供理论依据和实验基础。
方法：（1）利用TCGA（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）、Oncomine、GEO（Gene Expression Omnibus,基因表达公共数据库）3个公共数据库分析HOXA13基因在NPC中的表达情况，并在临床样本中进行验证；（2）通过慢病毒法构建稳定过表达和沉默HOXA13的NPC HNE1、CNE1细胞株及其相应的对照组：HNE1（野生型HNE1细胞）、CNE1（野生型CNE1细胞）、Ctrl组（仅含过表达空载体的细胞）、OEHOXA13组（稳定过表达HOXA13的细胞）、shCtrl组（仅含抑制空载体的细胞）、shHOXA13组（稳定沉默HOXA13表达的细胞），并采用荧光显微镜检测各组细胞的转染效率，RT-qPCR（Realtime Fluorescence Quantitative PCR,实时荧光定量PCR）实验检测各组细胞中HOXA13mRNA含量，Western-Blot实验检测各组细胞中HOXA13蛋白含量；（3）MTT实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞增殖能力的影响；（4）平板克隆形成实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞克隆形成能力的影响；（5）Transwell小室实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞迁移能力的影响；（6）铺有基质胶的Transwell小室实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞侵袭能力的影响；（7）RT-qPCR及Western-Blot分别检测迁移侵袭指标Snail、MMP-2mRNA及蛋白在HNE1、CNE1各组细胞中的表达情况。
结果：（1）①在TCGA数据库中发现，与癌旁组织相比，HOXA13在HNSCC（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,头颈部鳞状细胞癌）中明显高表达，且与HOTTIP的表达呈正相关；②在Oncomine、GEO数据库中发现HOXA13在NPC患者肿瘤组织中显著高表达；③检测临床样本中HOXA13的表达情况，发现HOXA13在NPC患者的肿瘤组织中高表达。（2）过表达和沉默HOXA13的NPC HNE1、CNE1细胞株建立和验证：①与HNE1-Ctrl组相比，HNE1-OEHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著上调；②与HNE1-shCtrl组相比，HNE1-shHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著降低；③与CNE1-Ctrl组相比，CNE1-OEHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著上调；④与CNE1-shCtrl组相比，CNE1-shHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著降低。（3）MTT实验结果显示：①在第2天、第3天、第4天时，HNE1-OEHOXA13组OD值显著高于HNE1组和HNE1-Ctrl组；②在第2天、第3天、第4天时，HNE1-shHOXA13组OD值显著低于HNE1组和HNE1-shCtrl组；③在第1天、第2天、第3天、第4天时，CNE1-OEHOXA13组OD值显著高于CNE1组和CNE1-Ctrl组；④在第2天、第3天、第4天时，CNE1-shHOXA13组OD值显著低于CNE1组和CNE1-shCtrl组。（4）克隆形成实验结果显示：①HNE1-OEHOXA13组的克隆形成率显著高于HNE1组和HNE1-Ctrl组；②HNE1-shHOXA13组的克隆形成率显著低于HNE1组和HNE1-shCtrl组；③CNE1-OEHOXA13组的克隆形成率显著高于CNE1组和CNE1-Ctrl组；④CNE1-shHOXA13组的克隆形成率显著低于CNE1组和CNE1-shCtrl组。（5）迁移实验结果显示：①HNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-Ctrl组显著增加；②HNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-shCtrl显著减少；③CNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-Ctrl组显著增加；④CNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-shCtrl组显著减少。（6）侵袭实验结果显示：①HNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-Ctrl组显著增加；②HNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-shCtrl组显著减少；③CNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-Ctrl组显著增加；④CNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-shCtrl显著减少。（7）迁移侵袭指标Snail、MMP-2在HNE1、CNE1各组细胞中的表达：①与HNE1组和HNE1-Ctrl组相比，HNE1-OEHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著上调；②与HNE1组和HNE1-shCtrl组相比，HNE1-shHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著降低；③与CNE1组和CNE1-Ctrl组相比，CNE1-OEHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著上调；④与CNE1组和CNE1-shCtrl组相比，CNE1-shHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著降低。
结论：（1）HOXA13在NPC组织中高表达；（2）通过慢病毒法成功构建稳定过表达和沉默HOXA13的NPC HNE1、CNE1细胞株；（3）过表达HOXA13可增强HNE1、CNE1细胞增殖及克隆形成能力；沉默HOXA13抑制HNE1、CNE1细胞增殖及克隆形成能力；（4）过表达HOXA13可促进HNE1、CNE1细胞迁移和侵袭能力；沉默HOXA13可抑制HNE1、CNE1细胞迁移和侵袭能力；（5）HOXA13可能通过调控Snail、MMP-2的表达影响NPC细胞的侵袭和迁移；（6）HOXA13在NPC中可能起着促癌基因的作用，有望成为NPC发病机制和治疗研究新的靶点。
方法：（1）利用TCGA（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）、Oncomine、GEO（Gene Expression Omnibus,基因表达公共数据库）3个公共数据库分析HOXA13基因在NPC中的表达情况，并在临床样本中进行验证；（2）通过慢病毒法构建稳定过表达和沉默HOXA13的NPC HNE1、CNE1细胞株及其相应的对照组：HNE1（野生型HNE1细胞）、CNE1（野生型CNE1细胞）、Ctrl组（仅含过表达空载体的细胞）、OEHOXA13组（稳定过表达HOXA13的细胞）、shCtrl组（仅含抑制空载体的细胞）、shHOXA13组（稳定沉默HOXA13表达的细胞），并采用荧光显微镜检测各组细胞的转染效率，RT-qPCR（Realtime Fluorescence Quantitative PCR,实时荧光定量PCR）实验检测各组细胞中HOXA13mRNA含量，Western-Blot实验检测各组细胞中HOXA13蛋白含量；（3）MTT实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞增殖能力的影响；（4）平板克隆形成实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞克隆形成能力的影响；（5）Transwell小室实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞迁移能力的影响；（6）铺有基质胶的Transwell小室实验检测过表达和沉默HOXA13对HNE1、CNE1细胞侵袭能力的影响；（7）RT-qPCR及Western-Blot分别检测迁移侵袭指标Snail、MMP-2mRNA及蛋白在HNE1、CNE1各组细胞中的表达情况。
结果：（1）①在TCGA数据库中发现，与癌旁组织相比，HOXA13在HNSCC（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,头颈部鳞状细胞癌）中明显高表达，且与HOTTIP的表达呈正相关；②在Oncomine、GEO数据库中发现HOXA13在NPC患者肿瘤组织中显著高表达；③检测临床样本中HOXA13的表达情况，发现HOXA13在NPC患者的肿瘤组织中高表达。（2）过表达和沉默HOXA13的NPC HNE1、CNE1细胞株建立和验证：①与HNE1-Ctrl组相比，HNE1-OEHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著上调；②与HNE1-shCtrl组相比，HNE1-shHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著降低；③与CNE1-Ctrl组相比，CNE1-OEHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著上调；④与CNE1-shCtrl组相比，CNE1-shHOXA13组中HOXA13mRNA及蛋白的表达显著降低。（3）MTT实验结果显示：①在第2天、第3天、第4天时，HNE1-OEHOXA13组OD值显著高于HNE1组和HNE1-Ctrl组；②在第2天、第3天、第4天时，HNE1-shHOXA13组OD值显著低于HNE1组和HNE1-shCtrl组；③在第1天、第2天、第3天、第4天时，CNE1-OEHOXA13组OD值显著高于CNE1组和CNE1-Ctrl组；④在第2天、第3天、第4天时，CNE1-shHOXA13组OD值显著低于CNE1组和CNE1-shCtrl组。（4）克隆形成实验结果显示：①HNE1-OEHOXA13组的克隆形成率显著高于HNE1组和HNE1-Ctrl组；②HNE1-shHOXA13组的克隆形成率显著低于HNE1组和HNE1-shCtrl组；③CNE1-OEHOXA13组的克隆形成率显著高于CNE1组和CNE1-Ctrl组；④CNE1-shHOXA13组的克隆形成率显著低于CNE1组和CNE1-shCtrl组。（5）迁移实验结果显示：①HNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-Ctrl组显著增加；②HNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-shCtrl显著减少；③CNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-Ctrl组显著增加；④CNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-shCtrl组显著减少。（6）侵袭实验结果显示：①HNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-Ctrl组显著增加；②HNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较HNE1组和HNE1-shCtrl组显著减少；③CNE1-OEHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-Ctrl组显著增加；④CNE1-shHOXA13组穿过的细胞数较CNE1组和CNE1-shCtrl显著减少。（7）迁移侵袭指标Snail、MMP-2在HNE1、CNE1各组细胞中的表达：①与HNE1组和HNE1-Ctrl组相比，HNE1-OEHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著上调；②与HNE1组和HNE1-shCtrl组相比，HNE1-shHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著降低；③与CNE1组和CNE1-Ctrl组相比，CNE1-OEHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著上调；④与CNE1组和CNE1-shCtrl组相比，CNE1-shHOXA13组中Snail、MMP-2mRNA及蛋白的表达显著降低。
结论：（1）HOXA13在NPC组织中高表达；（2）通过慢病毒法成功构建稳定过表达和沉默HOXA13的NPC HNE1、CNE1细胞株；（3）过表达HOXA13可增强HNE1、CNE1细胞增殖及克隆形成能力；沉默HOXA13抑制HNE1、CNE1细胞增殖及克隆形成能力；（4）过表达HOXA13可促进HNE1、CNE1细胞迁移和侵袭能力；沉默HOXA13可抑制HNE1、CNE1细胞迁移和侵袭能力；（5）HOXA13可能通过调控Snail、MMP-2的表达影响NPC细胞的侵袭和迁移；（6）HOXA13在NPC中可能起着促癌基因的作用，有望成为NPC发病机制和治疗研究新的靶点。