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研究目的:第一部分:胱氨酸谷氨酸转运蛋白(x CT)是氨基酸转运系统的功能性亚基,细胞膜上x CT的表达与细胞摄取胱氨酸关系密切,而胱氨酸是细胞内合成谷胱甘肽(GSH)所必不可少的,对维持细胞内谷胱甘肽水平起着重要的作用。GSH是细胞内重要的抗氧化剂,在维持细胞内氧化还原平衡中起重要作用。Sut突变小鼠,是经典的Hermansky Pudlak综合症小鼠模型,在sut细胞中,由于编码x CT蛋白的Slc7a11基因的突变,编码的蛋白变为x CT-sut,其C-端的9个氨基酸替代了野生型x CT的C-端20个氨基酸。我们前期的研究发现x CT缺陷能够抑制sut细胞的生长,并通过JNK信号通路触发细胞凋亡,但通过流式细胞仪分析发现凋亡细胞只占死亡细胞的一部分,其他死亡细胞是通过何种途径死亡的还不清楚。因此我们选取x CT缺陷的小鼠黑色素细胞sut作为研究对象,在前期工作的基础上进一步探讨x CT缺陷诱导细胞死亡的机制。第二部分:乳腺癌是全球女性最常见的癌症之一,在过去20年中大多数国家的发病率持续增长。癌细胞的转移性是乳腺癌高致死率的首要原因,癌细胞易发生转移,手术治疗的效果并不能令人满意。因此了解癌细胞转移的机制是降低癌症患者死亡率的重要因素。近年来研究发现x CT在多种高转移癌细胞中表达升高,我们在前期研究中也发现x CT在乳腺癌、肝癌和黑色素瘤中高表达。但其与乳腺癌转移的关系尚未报道,因此本研究旨在探讨x CT在乳腺癌转移过程中的作用及其机制。研究方法:第一部分:为确定sut细胞是否发生自噬,我们采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测了自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12的表达,采用Western blot方法检测了自噬标志物LC3-I、LC3-II以及Beclin1蛋白的表达;为确定x CT缺陷是否通过内质网应激途径诱导sut细胞发生自噬性死亡,我们检测了由内质网应激激活的主要信号转导通路中关键分子ATF6以及IRE1-XBP1的表达;然后用Western blot方法检测了Akt/m TOR/p70S6K信号通路中关键蛋白质磷酸化水平的改变,确定Akt/m TOR/p70S6K是否参与x CT缺陷诱导的自噬;最后,用p38 MAPK抑制剂SB203580处理sut细胞,以探讨p38 MAPK信号通路对x CT诱导的自噬的影响。第二部分:我们对人类高转移乳腺癌细胞株MDA-MB-231转染入SLC7A11-RNAi质粒,敲降x CT,然后利用细胞划痕实验和Transwell实验检测x CT敲降后,MDA-MB-231迁移及侵袭能力的改变。利用Western Blot和RT-PCR方法检测其自噬相关标志物LC3-I,LC3-II,EMT(上皮细胞间质化)过程相关标志物E-cadherin、Vimentin以及转录因子Snail表达水平的改变。确定EMT是否参与乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移,以及x CT是否通过自噬途径参与乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移。结果:第一部分:1.通过电子显微镜观察,发现x CT缺陷导致sut细胞中出现了脂滴和自噬体;在x CT缺陷的sut细胞中,自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12的表达升高,自噬相关标志物LC3-II/LC3-I的比值升高,Beclin1蛋白的表达上调;自噬抑制剂3-MA处理sut细胞48h后观察到细胞死亡数量减少。2.在x CT缺陷的sut细胞中,内质网应激激活的主要信号转导通路中关键分子ATF6的裂解胞质片段(ATF6f)迅速产生,但没有检测到XBP1的裂解片段。3.在x CT缺陷的sut细胞中检测到Akt在Thr308位点、m TOR在Thr2481位点、p70S6K在Thr389位点的磷酸化水平降低。4.苯基丁酸能够促进蛋白折叠以及抑制内质网应激,在x CT缺陷的sut细胞中加入苯基丁酸后,发现Akt在Thr308位点、m TOR在Thr2481位点、p70S6K在Thr389位点的磷酸化水平升高,苯基丁酸的加入抑制了LC3I向LC3II转换。5.在x CT缺陷的sut细胞中,p38 MAPK,ERK磷酸化水平升高,核转录因子NF-κB的表达水平升高;加入p38 MAPK抑制剂SB203580显著抑制了Beclin1的表达升高;加入苯基丁酸抑制了p38 MAPK磷酸化水平及ERK磷酸化水平。第二部分:1.人类低转移乳腺癌细胞MCF-7中x CT的表达明显低于人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231。2.敲降x CT后的MDA-MB-231细胞,与对照组相比,细胞划痕的愈合速度明显减慢,穿膜细胞明显减少。3.敲降xCT后,上皮细胞标志物E-cadherin的表达升高,间质细胞标志物Vimentin的表达降低;敲降x CT前后,MDA-MB-231细胞中转录因子Snail的m RNA水平没有明显的变化,而Snail的蛋白水平降低。4.敲降xCT后,MDA-MB-231细胞中LC3-II/LC3-I的比值增高。结论:第一部分:xCT缺陷能够诱导sut细胞发生内质网应激和自体吞噬。内质网应激通过激活p38 MAPK信号通路进而抑制Akt/m TOR/p70S6K信号通路,从而介导了x CT缺陷诱导的自噬,最终导致sut细胞的自噬性死亡。第二部分:x CT在人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达。敲降x CT的表达可以使人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231发生自噬,降解转录因子Snail,从而抑制EMT,降低人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移能力。