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胞外囊泡(Outer membrane?vesicles,OMVs)是细菌在生长过程中从细胞膜向细胞外空间分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡体。它含有细菌细胞膜蛋白、脂质和核酸等多种生物活性分子,在细胞间传递信号,具有多种生理功能,如:介导细菌-宿主间的相互作用、呈递细菌抗原、调节宿主免疫系统功能等。随着对OMVs生物学特性和功能的研究不断深入,OMVs作为细菌抗原载体的潜力及对宿主免疫系统的调控作用已引起学界的广泛关注。本试验以纳米级的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium,ST)胞外囊泡(ST-OMVs)作为免疫佐剂,探究其对肉仔鸡生长性能、血清免疫指标以及对抗ST感染能力的影响,为新型疫苗防控鸡沙门氏杆菌疾病奠定基础。试验一沙门氏菌胞外囊泡的分离鉴定与生物特性分析鼠伤寒沙门氏菌经过无菌环境下的纯化、培养,采用差速离心法从ST培养液上清中富集ST-OMVs,随后采用密度梯度离心法进行纯化得到纯化ST-OMVs。(1)扫描电镜检测ST-OMVs,结果显示:ST-OMVs的形态大小不一,无杂质视野清晰,平均直径为100 nm左右,符合细菌胞外囊泡的颗粒粒径要求。(2)采用激光纳米粒度分析仪检测所获得纯化ST-OMVs的粒径分布,结果显示MODE粒径的峰值为76 nm,其曲线平缓流利,说明含有的杂质较少,纯度较好。MODE粒径与细菌OMVs的理论颗粒粒径值基本吻合,偏离的小部分可能与颗粒之间的粘着程度有关。(3)采用BCA法检测ST-OMVs的蛋白含量,结果表明1×10~100 particles/mL的ST-OMVs的蛋白含量为7.3μg/mL。试验二沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡生产性能及预防沙门氏菌感染的效果研究350只1日龄健康爱拔益加雏鸡清洁环境中饲养至7日龄,选择沙门氏菌感染为阴性、健康、体重差异不显著的雏鸡320只随机等分为5组,每组8重复,每重复8只。试验设计为未感染的对照组(PBS组)、沙门氏杆菌感染组(ST组,攻毒试验用)和3个不同OMVs免疫剂量免疫组,分别注射5、10和20μg/d/只的OMVs(OMV5、OMV10和OMV20),试验期日粮和常规饲养管理按本品种饲养指南进行。雏鸡分别在8-10、15-17、22-24日龄3次、每次连续3天、每天1次性对3个OMVs免疫组雏鸡腹腔分别注射设计剂量的OMVs;同时,PBS组和ST组雏鸡分别注射等容量的PBS溶液。试验鸡30日龄时,对ST组和3个OMVs免疫组鸡腹腔1次性注射0.5 mL的1×10~9 CFU/m L的ST进行攻毒,PBS组鸡注射等容量的PBS溶液,饲养5天后观测鸡群健康变化;试鸡50日龄时,对前期试验健康观测最佳免疫OMV10组鸡腹腔1次性注射0.5 mL的5×10~9 CFU/mL的ST进行攻毒,饲养观察5天。结果表明:(1)OMVs对肉仔鸡生产性能和免疫功能影响试验与PBS对照组相比,OMV5和OMV10组的试验鸡日均采食量、平均日增重和饲料转化率均无显著差异(P>0.05),而OMV20组的试验鸡日均采食量和平均日增重显著降低(P<0.05)、饲料转化率显著增加(P<0.05);3个OMVs免疫组试验鸡的死亡率及免疫器官指数与PBS组均无显著差异(P>0.05);OMVs免疫可显著提高肉仔鸡血清溶菌酶活力、白蛋白含量、C3含量及SOD活力(P<0.05)。(2)OMVs对肉仔鸡ST攻毒后的免疫保护试验试期30日龄雏鸡对ST组和3个OMVs免疫组同剂量ST攻毒后观测5天发现,与ST组比较,3个OMVs免疫组鸡攻毒后均能够消除ST感染引起的试验鸡体重下降(P<0.05),显著提高(P<0.05)ST感染试验鸡的存活率,尤以OMV10和OMV20免疫组效果最好。此外,10μg/d/只的OMVs免疫可显著降低ST感染后血液中的IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05),且有降低IL-6含量的趋势(P=0.074)。试验第50天对PBS组和OMV10组攻毒后观测5天,两组鸡的存活率无显著差异(P>0.05),说明OMVs对肉仔鸡的免疫持久性良好。试验结论:(1)利用差速离心和密度梯度离心相结合的方式能获得纯化程度较高的OMVs;利用扫描电镜观察与Nanosight颗粒粒径分析相结合方法鉴定OMVs形态,准确性好。(2)OMVs具有增强肉仔鸡免疫的功效,主要表现在能提高肉仔鸡血清溶菌酶和SOD活力、以及白蛋白和C3含量;能够消除ST感染引起的肉仔鸡体重下降,提高ST感染后肉仔鸡存活率;OMVs对肉仔鸡抵抗ST感染的能力具有良好持久性。(3)OMVs增强肉仔鸡免疫具有明显的剂量效应。较大剂量(如20μg/d/只)会对肉仔鸡生产性能、甚或成活率造成负面影响;适度剂量则没有此效应。本试验中,10μg/d/只的免疫剂量为最佳免疫剂量。