论文部分内容阅读
一、研究背景：
癌症具有较高的发病率和致死率，严重威胁着人类的健康和生命。每年全世界约有700万人死于癌症，并且近几年肿瘤的死亡率呈明显上升趋势。目前，化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，因此新药的开发仍然是寻找攻克肿瘤的途径之一。
HER2/neu过表达与肿瘤的发生、转移、肿瘤血管形成、抗凋亡及化疗耐药等有关。针对HER2/neu的抗体Herceptin以及小分子酪氨酸激酶抑制剂Lapatinib已经被美国FDA批准在临床应用，对HER2/neu过表达的肿瘤具有很好的治疗效果。然而长期使用Lapatinib和Herceptin的病人出现耐药、严重的副作用和费用高等不利因素，因此有必要开发新的针对HER2/neu的治疗策略。
中药足中华民族的瑰宝，几千年来在防病治病上立下了不可磨灭的功绩，至今仍被广泛使用。随着现代科学技术的发展，人们开始深入研究中药对疾病的作用及原理，甚至从分子水平及基因水平上来研究其作用机制，以期找到新的化学药物实体，或扩大其治疗范围或增加新的适应征，达到充分挖掘中药的潜力为人类健康服务的目的。近年来，从中药中筛选抗肿瘤药物已经成为国内外研究的热点。人们希望通过对中药抗肿瘤作用和机制的研究寻找到新的、更有效的抗肿瘤药物，提高恶性肿瘤的治愈率。
二、方法：
以HER2/neu过表达的人类乳腺癌细胞株MDA—MB—453及人类肺腺癌细胞株Calu—3为研究对象，MTT法检测大黄素叠氮甲基蒽醌衍生物AMAD对这两种细胞的细胞毒作用；Hoechst33258染色并在荧光显微镜下观察AMAD作用后细胞凋亡的形态学改变；Annexin V/PI双染法分析细胞凋亡率；DNA琼脂糖凝胶电泳检测AMAD能否与DNA发生嵌合作用；以DiOC6为探针，流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm)；以DCFH—DA为探针，流式细胞仪测定细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平；Western Blot方法研究细胞凋亡及生存通路相关蛋白的变化。RT—PCR检测Her—2/neu转录水平的变化；蛋白Turn—over实验检测HER2/neu蛋白的稳定性；荧光显微镜观察HER2/neu蛋白在细胞中定位的变化；免疫沉淀检测HER2/neu蛋白的泛素化改变及与其分子伴侣Grp94结合情况。RNA干扰技术用于沉默Her—2/neu的表达。
三、结果：
(一)、AMAD诱导MDA—MB—453和Calu—3细胞发生凋亡及机制研究
1.MTT法体外筛选AMAD对HER2/neu过表达肿瘤细胞的细胞毒作用
大黄素AMAD对HER2/neu过表达的人类乳腺癌MDA—MB—453和人类肺腺癌Calu—3细胞表现出强的细胞毒作用，IC50值分别为9.06±0.95μ mol/L和0.83±0.21μ mol/L，而对鼠正常成纤维母细胞NIH3T3的IC50值大于100μ mol/L。以上数据提示这种新的大黄素衍生物可能具有潜在的抗HER2/neu高表达肿瘤的作用，因此本论文将重点探讨大黄素AMAD对这两种细胞的作用机制，为HER2/neu过表达肿瘤的治疗提供实验依据。
2.AMAD诱导MDA—MB—453和Calu—3细胞发生凋亡
为了证实AMAD是否能诱导MDA—MB—453和Calu—3细胞凋亡，我们采用多种研究方法检测AMAD对细胞的凋亡作用。2.30、4.60、9.20μmol/L和0.75、1.50、3.00μmol/L的AMAD分别作用于MDA—MB—453和Calu—3细胞48 h后，Hoechst33258染色在荧光显微镜下可见对照组细胞呈均匀弥散浅蓝色荧光，凋亡细胞可见浓染致密的颗粒状荧光，并有典型的凋亡小体形成。Annexin V/PI双染结果显示AMAD浓度依赖性地诱导这两种肿瘤细胞凋亡，而即使100μmol/LAMAD也不能诱导鼠正常纤维母细胞NIH3T3发生凋亡。Western Blot检测进一步检测到凋亡经典指标Caspase—3及PARP的裂解活化。以上结果均证实AMAD能诱导MDA—MB—453和Calu—3细胞发生凋亡。
3.AMAD诱导MDA—MB—453和Calu—3细胞发生凋亡的机制研究
3.1 AMAD与DNA之间无嵌合作用
大黄素AMAD同属蒽醌类化合物，为了考察AMAD是否与DNA发生嵌合从而诱导细胞凋亡，我们设计了DNA嵌合实验。结果表明，在AMAD与DNA的反应体系中，AMAD作用不同时间、不同浓度下的DNA荧光强度与对照相比无改变，而在已知的DNA嵌合剂表阿霉素(Epirubicin，EDR)作用下，DNA荧光强度与对照相比呈浓度和时间依赖性降低。结果提示EDR能够与DNA发生嵌合反应，而AMAD与DNA未发生嵌合反应，AMAD不是通过与DNA发生嵌合来诱导细胞凋亡的。
3.2 AMAD诱导的凋亡是通过ROS非依赖性的线粒体凋亡通路
AMAD诱导的凋亡是否与线粒体凋亡途径有关呢？我们对线粒体膜电位(△Ψm)的检测。结果表明，AMAD能诱导△Ψm改变；同时AMAD还诱导细胞内活性氧(ROS)水平的下降，并且加入抗氧化剂—还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)也不能对抗AMAD诱导的细胞凋亡，提示AMAD诱导的这两种细胞凋亡是ROS非依赖性的。Western Blot检测结果表明AMAD诱导的凋亡过程包括细胞色素c(Cyto—c)由线粒体释放至胞浆，Caspase—9活化裂解。以上结果提示，AMAD可能通过引起细胞线粒体膜电位(△Ψm)改变进一步导致Cyto—c从线粒体释放入胞浆，进而Caspase—9、Caspase—3及PARP依次裂解活化从而诱导线粒体途径的凋亡。
3.3 AMAD还可通过死亡受体途径诱导MDA—MB—453及Calu—3细胞凋亡
为了探讨AMAD诱导的凋亡是否与死亡受体途径有关，我们用Western Blot方法检测了死亡受体途径的启动Caspase即Caspase—8，结果发现在两种细胞均出现了Caspase—8的裂解；还出现了下游分子Bid的裂解活化，这表明AMAD还可通过死亡受体途径诱导凋亡。
3.4 AMAD诱导MDA—MB—453及Calu—3细胞凋亡的线粒体途径依赖于死亡受体途径
3.5 AMAD可以调节Bcl—2家族部分蛋白的表达
(二)、AMAD通过抑制PI3K/Akt及MAPK通路相关分子来抑制MDA—MB—453和Calu—3细胞生长
人类乳腺癌MDA—MB—453和人类肺腺癌Calu—3细胞是HER2/neu过表达的细胞株。通过化学合成的siRNA干扰HER2/neu后可见两种细胞生长受到明显的抑制，并且HER2/neu、p—Akt及p—ERK降低，提示HER2/neu对它们的生长至关重要。我们检测了大黄素AMAD对HER2/neu下游两条重要的生存通路即PI3K/Akt及MAPK通路相关蛋白的变化。经0，2.30，4.60，9.20μ mol/L和0，0.75，1.50，3.00μ mol/L AMAD分别作用于MDA—MB—453及Calu—3细胞48 h，p—Akt及p—ERK1/2浓度依赖性降低，并且Akt活性明显降低，表现为其下游p—FoxO1、p—GSK—3α/β及p—mTOR水平随AMAD浓度增加依次降低。
(三)、AMAD促进MDA—MB—453和Calu—3细胞HER2/neu蛋白经泛素—蛋白酶体通路降解
1.AMAD降低MDA—MB—453和Calu—3细胞HER2/neu蛋白表达；
2.AMAD降低HER2/neu蛋白表达与Her—2/neu基因转录水平无关 ；
3.AMAD降低HER2/neu蛋白表达可能与其蛋白稳定性降低有关；
4.AMAD促进HER2/neu蛋白在细胞中发生异位；
5.AMAD促进HER2/neu蛋白经泛素—蛋白酶体通路降解；
6.AMAD联合siRNA能进一步促进HER2/neu蛋白降解，抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡。
四、结论：
1.大黄素AMAD对HER2/neu过表达的人类乳腺癌MDA—MB—453和人类肺腺癌Calu—3细胞表现出强的细胞毒作用。
2.大黄素AMAD不是通过与DNA发生嵌合来诱导细胞凋亡。
3.大黄素AMAD是通过不依赖于ROS升高的Caspase-8/Bid促发的线粒体凋亡途径诱导MDA-MB-453和Calu-3细胞发生凋亡。
4.大黄素AMAD通过抑制PI3K/Akt及MAPK通路相关分子来抑制MDA-MB-453和Calu-3细胞生长。
5.大黄素AMAD促进HER2/neu蛋白经泛素-蛋白酶体通路降解。
6.大黄素AMAD联合siRNA能进一步促进HER2/neu蛋白降解，抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡。