阿尔兹海默症(Alzheimer’sdisease,AD)是一种与老龄化高度相关的神经退行性疾病,其主要病理特征为神经纤维缠结和老年斑的形成。神经纤维缠结主要由过度磷酸化的tau蛋白组成,而老年斑主要由β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)组成。当Aβ产生和清除失衡时,Aβ则在脑内聚集,形成老年斑。目前,清除Aβ异常在AD发展过程中的重要性已被普遍接受。作为重要的清除途径,Aβ降解酶的研究颇受关注,尤其是脑啡肽酶(neprilysin,NEP)和内皮素转换酶(endothelin converting enzyme,ECE),它们均能有效降解Aβ,但其在AD发病过程中的变化规律和相互关系尚待阐明。本论文主要分为以下几个方面的工作,并取得一定的科研成果:1)我们前期研究发现AD病人脑中NEPmRNA、蛋白水平和活性均低于非认知障碍(no cognitive impairment,NCI)组,而AD组ECE蛋白表达则高于NCI,提示Aβ降解酶NEP对AD发展过程中的Aβ清除发挥重要作用,ECE可能为NEP功能损害后的代偿途径。由于临床上散发型AD的确诊一般发生在疾病晚期,很难观察AD的发展过程。为此,我们使用APP/PS1双转基因小鼠模型对NEP和ECE的蛋白、活性在AD发展中的变化以及与Aβ沉积的关系进行探讨,探索其作为药物靶点的可能性,为开发新一代AD治疗药物提供理论和实验依据。我们首先研究了 APP/PS1小鼠大脑皮层和海马中NEP、ECE蛋白表达和活性随月龄增长的变化规律,评价它们在Aβ降解中的作用地位及相互关系,进一步探索NEP、ECE调节与AD疾病发展之间的关系。研究发现,在3、6、9、12月龄的APP/PS1小鼠大脑皮层和海马中,随月龄增长,Aβ4O和Aβ42水平持续上升,Aβ斑块结果类似,且水迷宫实验数据显示,小鼠达到9月龄时,才会出现认知功能障碍。此外,APP/PS1小鼠大脑皮层和海马中的NEP蛋白表达随月龄增长逐渐下降,而ECE水平逐渐上升;双免疫荧光染色实验显示,ECE和NEP共定位于胞浆和胞膜中;然而,在活性测试中,6月龄及更年长的APP/PS1小鼠大脑皮层和海马组织中,NEP和ECE的活性均明显下降,同时NEP和ECE的活性与Aβ水平呈负相关,表明NEP和ECE的活性与Aβ聚集紧密相关,影响AD疾病的发展,与AD病人类似。2)在AD发展过程中,我们推测膜结合的NEP亚细胞分布可能不同,影响Aβ的代谢过程,这可能引起NEP降解效率降低。因此,本论文我们研究了不同发病阶段的AD病人、APP/PS1小鼠以及人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型上NEP的亚细胞定位、活性以及功能的变化。在亚细胞分离组分中,我们发现轻度认知障碍(mild cognitive impairment,MCI)和AD病人大脑皮层胞浆中的NEP蛋白表达降低,而胞膜中的NEP增多,同时AD脑组织中胞膜与胞浆的NEP蛋白比率升高;相反,AD病人的NEP活性下降。拟AD转基因小鼠上的结果与之类似。在细胞水平上,4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,HNE)或Aβ诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的亚细胞分离组分中,胞浆中NEP的表达上调,而对应的NEP活性是下降的;HNE或Aβ处理后,48小时胞膜中NEP的活性升高、72小时显著下降,胞膜与胞浆中的NEP蛋白比率24小时升高,然后逐渐下降。这些结果表明HNE和Aβ可上调胞浆中NEP的表达,但是NEP活性没有升高,这可能暗示胞膜上NEP的活性发挥更重要的作用。HNE,脂质过氧化反应产生的代谢产物,可氧化修饰包括NEP在内的很多大分子,这可能是导致NEP活性降低的原因之一。为此,我们应用LTQ Velos Pro-Orbitrap Elite质谱解析了 HNE对NEP氧化修饰的位点,发现HNE通过Michael加成反应,可与NEP的93位和472位赖氨酸结合。这些结果表明NEP和ECE在抵制过量产生的Aβ聚集上发挥关键作用,在AD发展中,NEP功能损伤,而ECE表达上调可能改善了 Aβ代谢紊乱;亚细胞分离组分胞膜上的NEP发挥主要降解Aβ的作用;另外,确定HNE氧化修饰NEP的特定位点,为发现阻断该位点修饰的化合物提供实验基础。3)针对AD新靶标药物的探索:①为了寻找可能作用于Aβ降解酶靶点的有效药物,我们初步探索组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)抑制剂西达苯胺对NEP表达和活性的作用。研究发现西达苯胺上调了细胞中的NEP水平和胞膜上的NEP活性,降低了 Aβ水平,该发现为下一步的深入研究提供了有价值的线索。②过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是一种配体激活的转录因子,可参与调节脂质和葡萄糖代谢。PPARs家族有三种亚型,分别为PPARα、PPARβ/δ和PPARγ,其中PPARy研究最为广泛。目前,有大量证据表明PPARy激动剂噻唑烷二酮类药物(thiazolidinediones,TZDs),如罗格列酮和吡格列酮,能减轻神经退行性病变,抑制促炎因子的表达,改善轻中度AD病人和动物模型的认知能力。因此,以PPARγ为靶点的配体化合物将可能发展为治疗AD的候选药物。基于先导化合物TZDs,我们设计并合成了一系列2-硫代-4-噻唑烷酮衍生物,评价它们对PPARγ的结合活性。通过生物学测试,发现化合物18和38有很强的结合PPARy的活性,它们的Ki值分别为12.15 nM和14.46 nM。通过分析化合物的构效关系(structure-activity relationship,SAR),筛选有利的结构修饰。此外,化合物通过分子对接到PPARγ配体结合域,阐明它们的构效关系,探索可能的受体-配体相互作用。这些结果证明2-硫代-4-噻唑烷酮衍生物具有极佳的结合PPARγ的活性,它们将是一种有前景的新化合物。本论文为Aβ降解酶NEP和ECE在AD发展过程中的作用规律及药物干预的可能环节提供理论和实验依据,以HDAC抑制剂和PPARy为靶点的化合物为开发新一代的治疗AD药物提供新的方向。