一、研究背景及目的前列腺癌（prostate cancer）是中、老年男性常见的泌尿系恶性肿瘤。其发病率和病死率分别居全球男性癌症发病率的第二位和第六位。在美国，前列腺癌的发病率位居男性恶性肿瘤之首，居40岁以上男性癌症死因次席。目前中国等亚洲国家前列腺癌发病率虽远低于欧美等发达地区，但随着中国社会老龄化程度的加剧、肿瘤检测手段的提高及饮食、生活习惯、居住环境的改变，发病率呈明显增长趋势。因此，前列腺癌越来越受到人们的关注。其发生、发展、恶化机制和治疗手段研究已经成为泌尿外科的热点研究之一。前列腺癌（PCa）早期无相关临床症状，虽然目前血清前列腺特异性抗原（PSA）等筛查手段的应用，其检出率明显提高，但仍存在相当比例患者在确诊前列腺癌时处于疾病进展期:高血清PSA值，高Gleason评分、且发生局部或远处骨转移，从而失去根治性前列腺切除的机会而选择内分泌治疗。去势治疗对雄激素依赖型前列腺癌疗效确切，包括手术和药物去势两种方法，均可促使肿瘤细胞逐渐凋亡并降低患者PSA水平，缓解疼痛等症状，有效延缓肿瘤的恶化及转移。但内分泌治疗即最大雄激素阻断（MAB）的有效时间较短，其中位有效时间仅为14-30月，后期几乎所有患者都将发展为雄激素非依赖前列腺癌（AIPC）。对泌尿外科医师而言，发展为雄激素非依赖性前列腺癌（AIPC）的患者对内分泌治疗及化疗均不敏感且疾病恶化迅速，是无法治愈的阶段，患者中位生存时间仅18～20月。研究表明前列腺癌进展与雄激素受体及相关信号通路的改变密切相关，但激素依赖性前列腺癌如何转变为激素非依赖性前列腺癌的机制尚不清楚。因此，研究前列腺癌发生、发展、恶化、转移中雄激素受体及信号通路的作用以及受体相关的调控机制，极大有助于了解前列腺癌从激素依赖转变激素抵抗的分子机制。Micro-RNA是内源性非编码RNA分子，由长约18～25个单链核苷酸组成。研究表明，众多Micro-RNA不仅在多肽链的合成中发挥作用，而且能有效调节转录基因的表达，对细胞增殖、分化、凋亡和代谢等过程起着重要调节作用，其对肿瘤细胞生物学特性的调控是近年来医学、生物学等领域研究的热门，提示生物体内存在着由RNA介导的遗传信息表达调控网络。一个Micro-RNA可以调控多个靶基因，而一个靶基因又可同时被多个Micro-RNA所调控，不同类型的肿瘤以及肿瘤发生、进展、恶化中的不同阶段，都有自己独特的Micro-RNA异常表达谱.一般认为在动物细胞中，Micro-RNA主要通过不完全互补的方式与编码蛋白mRNA的碱基配对结合，引起目标靶mRNA的失活、降解或翻译受阻，从而在转录后水平进行对基因的调控。研究认为，microRNA-199a（缩写为miR-199a）在诸多人类恶性肿瘤中起抑制肿瘤细胞生长的调控作用，如乳腺癌、大肠癌、骨肉瘤等等，但是有关miR-199a对前列腺癌细胞的作用及相关调控机制至今未见相关文献报道。鉴于慢病毒载体系统能高效、稳定地将目的基因导入哺乳动物的原代或肿瘤细胞系且可以在体内长期稳定的表达，受免疫、内环境等影响小，安全性较高。我们拟通过基因芯片检测及临床肿瘤标本及癌旁组织验证miR-199a在前列腺癌组织及周围正常前列腺组织的差异表达，并通过构建miR-199a慢病毒过表达载体研究miR-199a表达水平的变化对前列腺癌激素非依赖细胞肿瘤生物学特性的影响，为后续针对miR-199a进行前列腺癌的分子靶向治疗奠定基础。二、研究方法、结果（一）microRNA-199a慢病毒过表达载体的构建及其效率验证慢病毒载体系统能稳定、高效地将目的基因导入哺乳动物的原代或肿瘤细胞系，且可以在体内长期稳定的表达，受免疫、内环境等影响小，安全性较高等优点。因此我们选择慢病毒载体体系构建pCDH-miR-199a载体。首先根据文献报道及Genebank查询的相关基因序列，合成特异性引物（带酶切位点），real-time PCR技术对目的基因片段进行扩增，RT-PCR产物双酶切及载体酶切后连接到pCDH体系中，经过阳性质粒转染293T细胞、慢病毒的获得、浓缩及滴度测定，通过荧光显微镜成像得出我们构建的pCDH-miR-199a慢病毒获得较高的浓度滴度。慢病毒感染前列腺癌激素非依赖DU-145细胞后，经PCR检测，结果证实构建的pCDH-miR-199a载体能显著上调miRNA-199a在DU-145细胞中表达水平。上述实验结果为后续进行miRNA-199a表达水平的变化对DU-145细胞肿瘤生物学特性的影响奠定了基础。（二）microRNA-199a在临床前列腺癌（PCa）组织中低表达（16对肿瘤与癌旁组织）首先利用基因芯片技术发现miR-199a在临床前列腺癌标本组织与癌旁正常的前列腺组织之间存在有统计学意义的表达差异。取经手术切除的前列腺癌和癌旁正常组织各16例，肿瘤组织的定位根据术前磁共振（MRI）等影像学检查、术前穿刺病理报告肿瘤阳性位点、前列腺切除组织的硬度触摸等手段来大体明确。术后病理切片染色明确所取标本组织包括前列腺癌和周围正常前列腺组织。所取的标本分别置入液氮中冻存和中性福尔马林溶液中固定。上述冻存及固定标本经RNA抽提、Poly(A)加尾和反转录反应、RT-PCR反应，结果发现16对术后病理诊断明确为前列腺癌与周围正常癌旁前列腺组织的miR-199a表达水平存在显著差异，与正常癌旁组织比较，肿瘤组织miR-199a的表达水平显著下降（P=0.07）。通过上述结果表明，miR-199a极有可能参与调控了前列腺癌的发生、发展及向激素非依赖转变等病理过程。（三）miR-199a高表达对前列腺癌细胞DU-145增殖、迁移、克隆形成及细胞周期与凋亡的影响。第三部分实验中，我们通过慢病毒载体介导miR-199a高表达，以研究miR-199a对前列腺癌激素非依赖细胞生物学特性方面的影响。我们选择DU-145细胞株为研究对象，通过慢病毒载体有效感染前列腺癌DU-145细胞，病毒感染后第五天在倒置荧光镜下观察得出慢病毒感染DU-145细胞效率高。通过细胞增殖实验检测DU-145细胞生长状况，与空白和阴性对照组相比，miRNA-199a高表达后的DU-145细胞的增殖能力明显受到抑制，酶标仪595nm检测的OD值降低。我们设计了Transwell实验研究miRNA-199a高表达后对雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU-145迁移能力的影响，结果发现，高表达miRNA-199a明显抑制前列腺癌DU-145细胞的迁移能力。肿瘤的克隆形成能力方面，我们通过DU-145细胞在平板上的克隆形成能力来反应并衡量肿瘤细胞的成瘤能力。我们发现，通过慢病毒载体介导miRNA-199a高表达后，DU-145细胞的克隆形成能力显著降低，表现为与con、Lv-shcon组相比，Lv-shmiRNA-199a组克隆的数目少，克隆的体积小，且克隆分散，成团能力差。在克隆形成实验中，我们发现高表达miRNA-199a明显抑制前列下癌DU-145细胞的克隆形成能力，具体表现为克隆体积小、分散，且成团能力差。为进一步探讨miRNA-199a高表达后对前列腺癌DU-145细胞周期产生的影响，我们利用PI染色流式细胞技术来检测细胞周期分布和细胞凋亡比例，根据细胞周期各阶段所含DNA的不同，来测定细胞的周期分布，结果发现表明miRNA-199a高表达后能够导致DU-145细胞出现G1/S期阻滞。此外，miRNA-199a高表达后能够促进DU-145细胞出现凋亡。三、结论综合以上三部分实验结果，我们认为：从芯片检测及临床组织标本验证miRNA-199a在前列腺癌中显著低表达，慢病毒载体能够高效、稳定的上调目标靶分子miRNA-199a在前列腺癌细胞中的水平，miRNA-199a可被作为肿瘤抑制因子抑制前列腺癌细胞的相关肿瘤生物学功能及特性，鉴于前列腺癌从激素依赖转向非依赖的具体机制目前尚未明确，miRNA-199a有可能被设计为抑制并治疗激素非依赖前列腺癌的靶向分子靶标。