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目的：骨肉瘤(osteosarcoma)是较常见的发生在20岁以下的青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤,在小儿骨恶性肿瘤中最多见,约为小儿肿瘤的5%。骨肉瘤起源于间叶组织,恶性程度高,侵袭性强,较早出现肺部转移,因而骨肉瘤患者的预后非常差,患者生存率很低,截肢后5年存活率仅为5-15%。现如今分子靶向治疗的出现,给骨肉瘤患者带来了新的福音。应激反应基因ATF3是P53的一个重要靶基因,在多种癌症中具有抑癌基因的作用,ATF3基因能调控细胞死亡,细胞周期。RITA (reactivation of p53and induction of tumor cell apoptosis)是一种P53靶向小分子抗癌化合物,诱导P53及其靶基因表达,在许多细胞系中导致大量细胞凋亡。本课题研究了ATF3基因在抗癌化合物RITA诱导的骨肉瘤细胞(U20S)凋亡中起到的调节作用。方法：不同浓度及时间长度RITA刺激骨肉瘤细胞系(U20S),通过Westerblot及荧光定量PCR测定ATF3蛋白及mRNA表达水平。将ATF3沉默载体转入骨肉瘤细胞系(U20S),建立稳定细胞系,RITA处理细胞,用MTT、流氏细胞术测定细胞凋亡水平,通过Westerblot及荧光定量PCR测定ATF3下游凋亡调控基因DR5、PUMA的蛋白及mRNA水平。结果：1、用0.2uM RITA处理U20S细胞后,取0,2,4,8,12,24小时收取蛋白及mRNA后,用westernblot及q-RTPCR检测ATF3蛋白及mRNA水平。结果显示：第0小时(即空白对照组)ATF3蛋白及mRNA表达水平极低,从第2小时开始ATF3蛋白及mRNA水平显著升高,而且随着时间延长ATF3蛋白及mRNA水平也随之增高,说明RITA对ATF3蛋白及mRNA水平的诱导具有时间依赖性。选取OuM,0.05uM,0.1uM,0.2uM,0.5uM,1uM RITA处理U20S细胞24小时后收取蛋白及mRNA,用westernblot及q-RTPCR检测ATF3蛋白及mRNA水平。结果显示：未用RITA处理的细胞(即空白对照组)ATF3蛋白及mRNA表达水平极低,而随着RITA浓度增加,ATF3蛋白及mRNA水平显著升高,说明RITA对ATF3蛋白及mRNA水平的诱导具有浓度依赖性。2、 ATF3siRNA转染U20S细胞系,分为：空白对照组,空白对照组+RITA, siATF3组,siATF3+RITA组,0.2uM RITA诱导时间为24小时,westernblot结果显示ATF3siRNA转染U20S细胞后,对比空白对照组及空白对照组+RITA组,siATF3组及siATF3+RITA组均很难检测到ATF3蛋白表达。3、用不同浓度RITA处理空白对照组及两个ATF3沉默组,MTT结果显示,RITA的不同浓度在固定的时间(72h)对骨肉瘤细胞的抑制作用存在差异,抑制作用随浓度的增大而增加；在同一浓度中,ATF3沉默组细胞较空白对照组对RITA的抵抗力显著增强。4、流式细胞术测定细胞凋亡siATF3组对比空白对照组,细胞凋亡率差别无统计学意义,siATF3+RITA组对比空白对照组+RITA组,细胞凋亡率显著降低。5、westernblot结果显示：siATF3组对比空白对照组,DR5、PUMA蛋白水平均显著降低,siATF3+RITA组对比空白对照组+RITA组,DR5、PUMA蛋白水平也显著降低。q-RTPCR结果显示：siATF3组对比空白对照组,DR5、PUMA mRNA水平无明显差异；siATF3+RITA组对比空白对照组·+RITA组,DR5、PUMA mRNA水平显著降低。结论：1、RITA诱导ATF3基因在骨肉瘤细胞U2OS中高表达。2、骨肉瘤细胞系U2OS中ATF3沉默后RITA无法诱导ATF3蛋白表达。3、ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强。4、ATF3基因沉默后骨肉瘤细胞U2OS对RITA抵抗力增强是通过调控下游凋亡基因实现的。