强直性脊柱炎(Ankylosing spotldylitis，AS)是严重危害人类健康的常见病和多发病，在我国人群中患病率为0.2％～6％。脊柱炎症病变从骶髂关节逐渐蔓延至颈椎，晚期常致关节严重变形，致使患者丧失劳动能力，导致生活质量明显下降。有关AS治疗策略的探索始终是国内外尤为关注的焦点、热点和难点。然而，时至今日由于对AS的病因认识不清，对其病机了解不透，目前尚无任何特异性根治疗法。所使用的药物与方案必然也就是非特异性缓解对症疗法，虽具有一定的对症缓解之效，但都是非靶向性的、对症不对因，也就必然会产生多种多样的严重毒副作用。因此，深入探索能有效防治AS的特异性新疗法或新药物是当今风湿病学、免疫学和药学领域亟待解决的重大问题。 上世纪七十年代初，美国科学家Brewerton和Schlosstein首先发现HLA-B27与AS之间存在着非常强的关联性，随后的大量研究结果都支持HLA-B27与AS之间在遗传学上密切关联的学说。近些年的实验研究业已表明，减少或阻断B27重链分子可以明显减轻症状和降低疾病的发生，其治疗机制可能是通过封闭B27分子的肽结合位点来阻断其呈递自身分子的功能，或干扰淋巴细胞对B27重链自身的识别来特异性阻断B27重链引起的病理性免疫反应。为此，本研究采用噬菌体展示技术拟筛选出HLA—B27重链相应的特异性结合肽，通过其与B27分子高度特异性结合，从而达到有效阻断自身免疫、预防和缓解AS的目的。基于结合肽的这一功能我们称之为HLA-B27分子拮抗肽(antagorlistic peptide)。从理论上讲，与目前的全身性免疫抑制疗法和抗炎对症治疗等非特异性治疗相比， HLA-B27分子拮抗肽治疗将会有更好的疗效和更轻的全身毒副作用。 HLA-B27分子是一种表达于所有有核细胞表面的人类主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子，由6号染色体MHC区编码的α重链及非MHC区编码的β2微球蛋白轻链组成，其亚型为HLA-B*2701～HLA-B*2725。在中国汉族人群中，B*2704和B*2705亚型构成了B27的优势型别，分别占50.85和40.68％。对中国汉族B27阳性AS患者的亚型分析亦显示B*2704频率最高，占54.8％，其次是B*2705，占41.1％，所以HLA-B*2704及B*2705基本涵盖了中国AS人群，因此我们选择这两个亚型作为本课题的研究靶标。 本研究第一部分是建立HLA-B*2704/B*2705永生化细胞株及克隆并鉴定其重链cDNA。首先从HLA-B*2704/B*2705阳性个体外周血中分离获得B淋巴细胞，然后建立EBV转化的HLA-B*2704/B*2705永生化细胞株，并对建立的细胞株进行了相关生物学特性的检测。检测结果提示转化后的HLA-B*2704/B*2705淋巴细胞具有永生性，且没有恶性转化的特征，核型分析无异常，裸鼠接种无致瘤性，基本保持了原代B淋巴细胞的生物学特征，属一般转化的细胞株。由此表明我们成功地建立了HLA-B*2704/B*2705阳性永生化细胞株，这为后续实验和国际间的交流提供了稳定的标本来源。随后，分别从建立的永生化细胞株及HLA-B*2704/B*2705阳性个体的外周血单个核细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增得到B*2704/B*2705重链的全长cDNA片段，将其连接测序载体上，转化大肠杆菌，酶切鉴定后测序表明，结果与Geribank中的已知序列数据完全一致，这为进一步进行HLA-B*2704/B*2705重链在原核系统中的可溶性蛋白表达奠定了基础。 本研究第二部分是将编码HLA-B*2704和HLA-B*2705分子的重链胞外区cDNA在E．coli中进行可溶性表达。以HLA-B*2704/B*2705重链全长cDNA为模板，设计重链胞外区引物，PCR扩增HLA-B*2704/B*2705的重链胞外区编码序列，并插入到pEF32a-c(+)融合表达载体中，热休克转化Origami宿主菌，阳性菌落活化后，经IPTG诱导获得了重组融合蛋白的高效表达，表达量占菌体总蛋白的>50％。进一步的实验表明，可溶性表达与包涵体之间的比例与诱导温度密切相关，30℃诱导主要以可溶性形式存在，而37℃诱导主要以包涵体的形式存在，在不同诱导温度条件下，可溶性蛋白所占的比例依次为30℃>25℃>37℃，这可能与不同温度环境下菌体内微环境的不同而造成的蛋白溶解度的改变有关，而IPTG浓度对产量无显著影响。由此表明本研究实现了B*2704/B*2705重链胞外区蛋白的高效可溶性表达，并获得较纯的目的蛋白，纯度≥80％；阻断试验表明，pET32a-c(+)-B*2704或B*2705表达上清可阻断抗HLA-B27抗体介导的补体依赖性淋巴细胞毒反应，说明本研究获得了具有生物活性的HLA-B*2704或B*2705重链胞外区，为进行噬菌体随机肽库的筛选及其他相关工作创造了条件。 本研究第三部分则是进行HLA-B*2704及B*2705拮抗肽的筛选和初步鉴定。将可表达获得的重组蛋白用酶联板法来筛选噬菌体随机12肽库，经过3轮生物淘洗(biopanning)后，噬菌体克隆得到了有效富集。随机挑取20～40个噬菌体克隆(其中从B*2704挑选12个克隆，B*2705挑选10个克隆)进行ELISA检测分析和单链DNA(single strand DNA，ssDNA)序列测定表明。获得的HLA-B*2704拮抗肽共有5种序列，分别为：1、HTSFCSTHLCLI(×4)，2、QHCSLTLCQIHR(×5)，3、ARCTTTLCYLSN(×1)，4、YGLCTDWYCHIT(×1)，5、YPLCDAILCRLP(×1)；10个B*2705拮抗肽共有4种序列，分别为：1、SHCSPHWCALPF(×6)，2、HLCSNSLCLLPW(×2)，3、EPMCSWFWCTLP(×1)，4、WTCSPLLCTWGA(×1)。比对分析表明，B*2704与B*2705拮抗肽的序列是基本一致的，均含有CS(T)TXXl(W)CXL表位，说明此表位可能是拮抗肽与B*2704/B*2705分子重链的主要拮抗表位。采用免疫荧光显微镜直接观察表明，所筛选到的B*2704/B*2705拮抗肽的噬菌体克隆与正常B细胞不进行结合，但却可分别与HLA-B*2704及B*2705细胞株结合。流式细胞术分析进一步显示，展示有B*2704拮抗肽的噬菌体克隆可与HLA-B*2704细胞株结合，阳性率为43.55％；而B*2705拮抗肽噬菌体克隆与HLA-B*2705细胞株的阳性结合率为45.69％。上述结果初步表明，筛选获得的B27拮抗肽的噬菌体克隆具有一定的亲和力，可与表达于细胞株表面的B*2704和B*2705分子特异性结合，而与正常B细胞不结合，因而表现出一定的结合特异性。 总之，本研究成功地建立了HLA-B*2704/B*2705阳性永生化细胞株，克隆了HLA-B*2704及B*2705全长cDNA，并在原核系统中对其重链胞外区编码基因进行了可溶性的表达和纯化研究，用获得的重链胞外区蛋白筛选噬菌体随机肽库，初步获得了HLA-B*2704及B*2705的拮抗肽，并对其表达情况及生物学功能进行了初步的探索，这为今后深入系统地研究该拮抗肽在阻断或干扰强直性脊柱炎模型中的作用打下了基础，也为临床AS疾病的防治提供了新的方法与思路。